Նորություններ

Վարակիչ հիվանդությունների հայտնաբերման ավանդական ախտորոշման ռազմավարությունները պահանջում են նստարանային գործիքների օգտագործում, որոնք հարմար չեն խնամքի կետի թեստավորման համար (POCT):Զարգացող միկրոհեղուկները խիստ մանրացված, ավտոմատացված և ինտեգրված տեխնոլոգիա է, որը պոտենցիալ այլընտրանք է ավանդական մեթոդներին արագ, էժան, ճշգրիտ տեղում ախտորոշման համար:Մոլեկուլային ախտորոշման մեթոդները լայնորեն կիրառվում են միկրոհեղուկ սարքերում որպես պաթոգենների հայտնաբերման ամենաարդյունավետ մեթոդներ:Այս ակնարկն ամփոփում է վարակիչ հիվանդությունների միկրոհեղուկի վրա հիմնված մոլեկուլային ախտորոշման վերջին առաջընթացները ինչպես ակադեմիական, այնպես էլ արդյունաբերական տեսանկյունից:Նախ, մենք նկարագրում ենք նուկլեինաթթուների տիպիկ չիպի մշակումը, ներառյալ նմուշի նախնական մշակումը, ուժեղացումը և ազդանշանի ընթերցումը:Այնուհետև համեմատվում են չորս տեսակի միկրոհեղուկ հարթակների բնութագրերը, առավելություններն ու թերությունները:Հաջորդիվ մենք կքննարկենք թվային վերլուծությունների կիրառումը նուկլեինաթթուների բացարձակ քանակականացման համար:Ինչպես դասական, այնպես էլ վերջերս առևտրային միկրոհեղուկի վրա հիմնված մոլեկուլային ախտորոշիչ սարքերը ամփոփված են որպես շուկայի ներկա վիճակի ապացույց:Ի վերջո, մենք առաջարկում ենք վարակիչ հիվանդությունների միկրոհեղուկ ախտորոշման ապագա ուղղություններ։
Վարակիչ հիվանդությունները պայմանավորված են պաթոգեններով, ներառյալ բակտերիաները, վիրուսները և մակաբույծները, որոնք տարածված են ամբողջ աշխարհում:Ի տարբերություն այլ հիվանդությունների, հարուցիչները արագ վարակվում են և տարածվում մարդկանց և հյուրընկալող կենդանիների միջև պատվաստման, օդի և ջրային միջավայրի միջոցով [1]:Վարակիչ հիվանդությունների կանխարգելումը կարևոր է որպես հանրային առողջության միջոց:Վարակիչ հիվանդությունների դեմ պայքարի երեք հիմնական ռազմավարություն. (1) վերահսկել վարակի աղբյուրը.(2) փոխանցման ուղու ընդհատում.(3) խոցելի բնակչության պաշտպանություն:Հիմնական ռազմավարությունների շարքում վարակի աղբյուրի վերահսկումը համարվում է ամենակարեւոր ռազմավարությունը՝ շնորհիվ իր հարմարության և ցածր գնի։Վարակված անհատների արագ ախտորոշումը, մեկուսացումը և բուժումը կարևոր նշանակություն ունեն, որոնք պահանջում են արագ, զգայուն և ճշգրիտ ախտորոշման ռազմավարություններ [2]:Վարակիչ հիվանդությունների ներկայիս ախտորոշումը սովորաբար համատեղում է կլինիկական հետազոտությունը՝ հիմնված նշանների և ախտանիշների և լաբորատոր հետազոտությունների վրա, ինչպիսիք են բջջային կուլտուրան և մոլեկուլային ախտորոշումը, որոնք պահանջում են պատրաստված անձնակազմ, աշխատատար ընթացակարգեր և թանկարժեք փորձարկման սարքավորումներ [3, 4]:Վարակիչ հիվանդությունների բռնկումների կանխարգելումը պահանջում է արագ, էժան և ճշգրիտ տեղական ախտորոշում, հատկապես ռեսուրսներով սահմանափակ տարածքներում, որտեղ վարակիչ հիվանդությունները տարածված են և ծանր [5], ինչպես նաև բուժում անապատում կամ մարտի դաշտում, որտեղ արտակարգ իրավիճակներն անկանխատեսելի են:.բժշկական օգնությունը սահմանափակ է [6]:Այս համատեքստում միկրոհեղուկությունը տեխնոլոգիա է, որը միավորում է միկրոէլեկտրամեխանիկական համակարգերի տեխնոլոգիաները, նանոտեխնոլոգիաները կամ նյութերի գիտությունը հեղուկի ճշգրիտ մանիպուլյացիայի համար [7,8,9,10]՝ ապահովելով խնամքի կետի հայտնաբերման նոր հնարավորություններ (POCT):) վարակիչ նյութեր հիվանդանոցներից և լաբորատորիաներից դուրս:Համեմատած ավանդական ժամանակատար ախտորոշման հետ՝ միկրոհեղուկ տեխնոլոգիան առաջարկում է նմուշների և ծախսերի խնայողություն հիվանդության բռնկման ժամանակ մոլեկուլային ախտորոշման համար:Կորոնավիրուսային հիվանդության գլոբալ տարածումը 2019 (COVID-19) պայմանավորված է ծանր սուր շնչառական համախտանիշով կորոնավիրուս 2 (SARS-CoV-2), ուստի միկրոֆլյուիդիկայի կարևորությունը համաճարակի ժամանակին կանխարգելման և վերահսկման համար կրկին ընդգծվում է [11, 12: , 13]։Ի տարբերություն ավանդական ախտորոշման, միկրոհեղուկային POCT-ն օգտագործում է փոքր շարժական սարքեր՝ սկսած նստարանային անալիզատորներից մինչև կողային հոսքի փոքր փորձարկման ժապավեններ՝ նմուշառման կետի մոտ փորձարկելու համար [14]:Այս թեստերը բնութագրում են պարզեցված կամ առանց նմուշի պատրաստում, ազդանշանի արագ ուժեղացում և զգայուն ազդանշանի ընթերցումներ, որոնք հանգեցնում են կարճ տևողության և ճշգրիտ արդյունքների րոպեների ընթացքում:Միկրոհեղուկի վրա հիմնված առողջապահական գործիքների առկայությունը և զանգվածային արտադրությունը ընդլայնել են դրանց ծախսարդյունավետ և ուղղակի ախտորոշման կիրառությունները հիվանդանոցից դուրս, հիվանդի մոտ և նույնիսկ տանը:
Վարակիչ հիվանդությունների ախտորոշման գոյություն ունեցող ռազմավարությունների շարքում մոլեկուլային ախտորոշումը ամենազգայուններից է [15, 16]:Բացի այդ, մոլեկուլային ախտորոշումը հաճախ օգտագործվում է որպես ոսկե ստանդարտ COVID-19-ի շարունակական հայտնաբերման համար, որը թույլ է տալիս ուղղակիորեն հայտնաբերել ՌՆԹ-ի կամ ԴՆԹ-ի վիրուսին հատուկ շրջանները մինչև իմունային պատասխանի սկիզբը [17, 18]:Ընթացիկ վերանայման մեջ մենք ներկայացնում ենք վարակիչ հիվանդությունների միկրոհեղուկի վրա հիմնված մոլեկուլային ախտորոշման գործընթացների վերջին առաջընթացները՝ ակադեմիական տեսանկյունից մինչև ապագա արդյունաբերական հեռանկարներ (նկ. 1):Մենք կսկսենք նուկլեինաթթվի հայտնաբերման երեք հիմնական քայլերից՝ չիպի վրա նմուշի նախնական մշակում, նուկլեինաթթվի ուժեղացում և ազդանշանի ընթերցում:Այնուհետև մենք համեմատեցինք տարբեր տեսակի միկրոհեղուկ հարթակներ իրենց կառուցվածքով և գործառույթներով՝ ցույց տալով յուրահատուկ բնութագրեր (ուժեղ և թույլ կողմեր):Թվային նուկլեինաթթվի հայտնաբերումը հետագայում քննարկվում և բերվում է որպես երրորդ սերնդի տեխնոլոգիայի օրինակ վարակիչ պաթոգեն մոլեկուլների բացարձակ քանակականացման համար:Բացի այդ, կներկայացվեն մի քանի տիպիկ և վերջին առևտրային POCT սարքեր՝ ցույց տալու համար մոլեկուլային ախտորոշման միկրոհեղուկային POCT շուկայի ներկա վիճակը:Մենք նաև կքննարկենք և կբացատրենք ապագա հայտերի մեր տեսլականը:
Նուկլեինաթթուների հայտնաբերման համար միկրոհեղուկ չիպերի մոդուլները կարելի է բաժանել երեք կատեգորիայի (նմուշառում, ճանաչում և ազդանշան)՝ ըստ իրենց գործառույթների [19]:Այս մոդուլներից նմուշառման մոդուլը հիմնականում իրականացնում է նմուշի լիզի և նուկլեինաթթվի արդյունահանում:Սենսորային մոդուլը հիմնականում վերահսկում է նուկլեինաթթվի ազդանշանների փոխակերպումն ու ուժեղացումը։Ազդանշանային մոդուլը հայտնաբերում է զգայուն մոդուլի կողմից փոխարկված և մշակված ազդանշանը:Հիմնվելով չիպի վրա նուկլեինաթթուների հայտնաբերման գործընթացի վրա՝ մենք կամփոփենք այն տարբեր չիպերը, որոնք կարող են իրականացնել «մուտքային և ելքային» գործառույթը:
Նուկլեինաթթվի հայտնաբերման առաջին քայլը նուկլեինաթթվի արդյունահանումն է, այսինքն՝ նպատակային նուկլեինաթթվի մեկուսացումը սկզբնական նմուշից:Նուկլեինաթթվի արդյունահանումն իրականացվում է այլ մոլեկուլային աղտոտիչներից նուկլեինաթթուները մաքրելու, նուկլեինաթթվի մոլեկուլների առաջնային կառուցվածքի ամբողջականությունն ապահովելու և արդյունքները օպտիմալացնելու նպատակով:Նուկլեինաթթվի արդյունահանումը պահանջում է անհրաժեշտ նմուշի լիզում և նուկլեինաթթվի հավաքում, որի որակն ու արդյունավետությունը հսկայական ազդեցություն ունեն հետազոտության և ախտորոշման արդյունքների վրա:Արդյունահանման ընթացքում ցանկացած նուրբ կողմնակի ազդեցություն կարող է սահմանափակել հետագա հայտնաբերումը:Օրինակ, պոլիմերազային շղթայական ռեակցիայի (PCR) և հանգույցի իզոթերմային ուժեղացման (LAMP) մեթոդները արգելակվում են որոշ մնացորդային օրգանական լուծիչներով, ինչպիսիք են էթանոլը և իզոպրոպանոլը նուկլեինաթթվի մեկուսացման ռեակտիվներում [20]:Հեղուկ-հեղուկ արդյունահանումը և պինդ փուլային արդյունահանումը նուկլեինաթթուների մեկուսացման ամենատարածված մեթոդներն են [21], սակայն չիպի վրա հեղուկ-հեղուկ արդյունահանումը չափազանց սահմանափակ է, քանի որ հեղուկ-հեղուկ արդյունահանման մեջ օգտագործվող ռեակտիվները առաջացնում են միկրոհեղուկ չիպերի մեծ մասի կոռոզիա: .Այստեղ մենք ընդգծում ենք միկրոզանգվածի վրա հիմնված պինդ փուլային արդյունահանման մեթոդները և համեմատում դրանց առավելություններն ու թերությունները:
Սիլիցիումը նուկլեինաթթուների հետ համատեղելի ենթաշերտ նյութ է՝ շնորհիվ իր կենսահամատեղելիության, կայունության և փոփոխման հեշտության [22]:Կարևորն այն է, որ երբ ձևափոխվում է սիլիցիումի կամ այլ նյութերի հետ, այս կոմպոզիտը ցուցադրում է բացասական լիցքավորված նուկլեինաթթուներ կլանելու հատկություն ցածր pH-ի և աղի բարձր պայմաններում՝ միաժամանակ ողողելով բարձր pH, ցածր աղի լուծույթներով:Այս երեւույթի հիման վրա հնարավոր է մաքրել նուկլեինաթթուն։
Սիլիցիումի վրա հիմնված նյութերի տարբեր ձևեր օգտագործվել են միկրոհեղուկներում նուկլեինաթթվի արդյունահանման համար, ինչպիսիք են սիլիցիումի ուլունքները, փոշիները, միկրոֆիբրային ֆիլտրերը և սիլիցիումի թաղանթները [23, 24, 25, 26]:Կախված նյութի հատկություններից, սիլիցիումի վրա հիմնված նյութերը կարող են օգտագործվել միկրոսխեմաներում տարբեր ձևերով:Օրինակ, սիլիցիումի հատիկներ, փոշիներ և առևտրային նանոֆիլտրերը կարող են պարզապես տեղադրվել միկրոհեղուկ չիպերի ծակոտիների կամ միկրոալիքների մեջ և օգնել նմուշներից նուկլեինաթթուներ հանել [27, 28, 29]:Մակերեւութային ձևափոխված սիլիցիումի թաղանթները կարող են օգտագործվել նաև ցածր գնով պաթոգեններից ԴՆԹ-ի արագ մաքրման համար:Օրինակ, Wang et al.[30] Դենատուրացիոն ուժեղացման ռեակցիաները զուգակցելով վեզիկուլային միջնորդավորված շղթայական փոխանակման հետ խիտոզանի օլիգոսաքարիդներով պատված սիլիցիումի թաղանթների հետ՝ ներդրվեց բազմակողմանի շարժական համակարգ, որը հաջողությամբ հայտնաբերեց 102-108 գաղութներ ձևավորող միավորներ։(CFU)/ml Vibrio parahaemolyticus:, իսկ վիրուսի առկայությունը հեշտությամբ տեսանելի էր։Փաուելը և այլք:[31] Սիլիցիումի վրա հիմնված միկրոզանգվածներն այնուհետև օգտագործվեցին հեպատիտ C-ի վիրուսը (HCV), մարդու իմունային անբավարարության վիրուսը (ՄԻԱՎ), Զիկա վիրուսը և մարդու պապիլոմավիրուսը հայտնաբերելու և ավտոմատ տարածման համար, որոնցում ստեղծվեց 1,3 մկլ ոլորուն միկրոռեակտոր՝ ՌՆԹ վիրուսները գրավելու համար։և կատարել տեղում ուժեղացում:Բացի այս մեթոդներից, մակերեսային ձևափոխված սիլիցիումի միկրոսյուները նույնպես առանցքային դեր են խաղում նուկլեինաթթվի արդյունահանման գործում, քանի որ փոփոխվող նյութի երկրաչափությունն ու հատկությունները մեծապես մեծացնում են արդյունահանման արդյունավետությունը:Chen et al.[32] առաջարկել է միկրոհեղուկ հարթակ ցածր կոնցենտրացիայի ՌՆԹ-ի մեկուսացման համար, որը հիմնված է ամինապատված սիլիցիումի միկրոսյուների վրա։Այս միկրոհեղուկ սարքը միավորում է 0,25 սմ2 միկրոսյունների զանգվածը սիլիկոնային հիմքի վրա՝ արդյունահանման ավելի բարձր արդյունավետության հասնելու համար՝ մակերեսի և ծավալի հարաբերակցության բարձր դիզայնի միջոցով:Այս դիզայնի առավելությունն այն է, որ միկրոհեղուկ սարքը կարող է հասնել մինչև 95% նուկլեինաթթվի արդյունահանման արդյունավետության:Սիլիցիումի վրա հիմնված այս ռազմավարությունները ցույց են տալիս ցածր գնով արագ մեկուսացնող նուկլեինաթթուների արժեքը:Սիլիցիումի վրա հիմնված արդյունահանման ռազմավարությունները, միկրոհեղուկ չիպերի հետ համատեղ, կարող են ոչ միայն բարձրացնել նուկլեինաթթվի հայտնաբերման արդյունավետությունը, այլև հեշտացնել անալիտիկ սարքերի մանրացման և ինտեգրման գործընթացը [20]:
Մագնիսական տարանջատման մեթոդները օգտագործում են մագնիսական մասնիկներ՝ արտաքին մագնիսական դաշտի առկայության դեպքում նուկլեինաթթուները մեկուսացնելու համար։Սովորաբար օգտագործվող մագնիսական մասնիկները ներառում են Fe3O4 կամ γ-Fe2O3 մագնիսական մասնիկներ՝ պատված սիլիցիումով, ամինով և կարբոքսիլով [33,34,35,36]:Մագնիսական մասնիկների տարբերակիչ առանձնահատկությունը՝ համեմատած սիլիցիումի վրա հիմնված SPE մեթոդների հետ, արտաքին մագնիսներով մանիպուլյացիայի և վերահսկման հեշտությունն է:
Օգտագործելով նուկլեինաթթուների և սիլիցիումի էլեկտրաստատիկ փոխազդեցությունը, բարձր աղի և ցածր pH-ի պայմաններում նուկլեինաթթուները ներծծվում են սիլիցիումի ծածկույթով մագնիսական մասնիկների մակերեսի վրա, մինչդեռ ցածր աղի և բարձր pH-ի պայմաններում մոլեկուլները կարող են լվանալ: կրկին..Սիլիցիումով պատված մագնիսական բշտիկները հնարավորություն են տալիս մեծ ծավալի նմուշներից (400 մկլ) ԴՆԹ-ի արդյունահանումը՝ օգտագործելով մագնիսական կառավարվող շարժում [37]:Որպես ցուցադրություն, Ռոդրիգես-Մատեոս և այլք.[38] օգտագործեց կարգավորվող մագնիսներ՝ վերահսկելու մագնիսական ուլունքների փոխանցումը տարբեր խցիկներ։Սիլիցիումով պատված մագնիսական մասնիկների հիման վրա SARS-CoV-2 գենոմային ՌՆԹ-ի 470 օրինակ/մլ կարող է արդյունահանվել կեղտաջրերի նմուշներից՝ LAMP հակադարձ տառադարձման հայտնաբերման համար (RT-LAMP) և պատասխանը կարելի է կարդալ 1 ժամվա ընթացքում:անզեն աչք (նկ. 2ա):
Սարքեր, որոնք հիմնված են մագնիսական և ծակոտկեն նյութերի վրա:IFAST RT-LAMP միկրոհեղուկ սարքի հայեցակարգային դիագրամ SARS-CoV-2 ՌՆԹ-ի հայտնաբերման համար (հարմարեցված է [38]-ից):b Կենտրոնախույս միկրո սարք՝ բուկալային շվաբր նուկլեինաթթվի dSPE-ի համար (հարմարեցված է [39]-ից):c Ներկառուցված ինքնասնուցմամբ նմուշների համակենտրոնացումը FTA® քարտի միջոցով (հարմարեցված է [50]-ից):d Fusion 5 ֆիլտր թուղթ՝ ձևափոխված խիտոզանով (հարմարեցված է [51]-ից):SARS-CoV-2 սուր սուր շնչառական համախտանիշ՝ կորոնավիրուս 2, RT-LAMP հակադարձ տառադարձման հանգույցի միջնորդավորված իզոթերմային ուժեղացում, FTA որոնիչների տեխնոլոգիայի գործընկերներ, ԱԺ նուկլեինաթթու
Դրական լիցքավորված մագնիսական մասնիկները իդեալական են նուկլեինաթթվի ֆոսֆատային ողնաշարը միացնելու համար:Աղի որոշակի կոնցենտրացիայի դեպքում նուկլեինաթթուների բացասական լիցքավորված ֆոսֆատային խմբերը կարող են դրական լիցքավորվել մագնիսական կոմպոզիտային մասնիկների մակերեսի վրա։Հետևաբար, նուկլեինաթթուների արդյունահանման համար մշակվել են կոպիտ մակերեսով և ամինային խմբերի բարձր խտությամբ մագնիսական նանոմասնիկներ։Մագնիսական տարանջատումից և արգելափակումից հետո մագնիսական նանոմասնիկները և ԴՆԹ-ի համալիրները կարող են ուղղակիորեն օգտագործվել PCR-ում, ինչը վերացնում է մաքրման և էլյուցիայի բարդ և ժամանակատար գործողությունների անհրաժեշտությունը [35]:Բացասական կարբոքսիլային խմբերով պատված մագնիսական նանոմասնիկներն օգտագործվել են նաև մակերևույթների վրա ներծծված նուկլեինաթթուները առանձնացնելու համար բարձր կոնցենտրացիայի պոլիէթիլեն գլիկոլի և նատրիումի քլորիդի լուծույթներում [36]:Մակերեւութային ձևափոխված այս մագնիսական ուլունքներով ԴՆԹ-ի արդյունահանումը համատեղելի է հետագա ուժեղացման հետ:Դիգնանը և այլք:[39] նկարագրել է նուկլեինաթթվի նախնական մշակման ավտոմատ և շարժական կենտրոնախույս միկրոհեղուկ հարթակ, որը թույլ է տալիս ոչ տեխնիկական անձնակազմին օգտագործել այն տեղում։Ի լրումն, մեկուսացված ԴՆԹ-ի համատեղելիությունը LAMP-ի հետ, մեթոդ, որը լավ հարմարեցված է խնամքի կետում նուկլեինաթթուների վերլուծության համար, հետագայում ցույց է տալիս սարքավորումների նվազագույն պահանջները և գունաչափական անալիզների համապատասխանությունը (նկ. 2b):
Մագնիսական բշտիկների մեթոդներն առաջարկում են ավտոմատ արդյունահանման հնարավորություն, որոնցից մի քանիսը գոյություն ունեն առևտրային ավտոմատացված նուկլեինաթթուների արդյունահանման սարքերում [KingFisher;ThermoFisher (Waltham, MA, ԱՄՆ), QIAcube® HT;CapitalBio (Պեկին, Չինաստան) և Biomek®;Բեքման (Մայամի, ԱՄՆ).), Ֆլորիդա, ԱՄՆ)]։Մագնիսական ուլունքները միկրոհեղուկների հետ համատեղելու առավելությունները կարող են օգտագործվել նուկլեինաթթուների արդյունավետ ավտոմատացված արդյունահանման համար, ինչը կարող է պոտենցիալ խթանել մոլեկուլային ախտորոշման զարգացումը.Այնուամենայնիվ, մագնիսական ուլունքների և միկրոհեղուկների համադրությունը դեռևս մեծապես հիմնված է մագնիսական ուլունքների ճշգրիտ մանիպուլյացիայի համար բարդ կառավարման համակարգերի վրա, ինչը բացատրում է առևտրային արտադրանքի զանգվածային և թանկ լինելու ժողովրդականությունը, ինչը սահմանափակում է մագնիսական ուլունքների հետագա կիրառումը POCT-ում:
Նուկլեինաթթվի հայտնաբերման համար օգտագործվել են նաև մի քանի ծակոտկեն նյութեր, ինչպիսիք են փոփոխված նիտրոցելյուլոզային ֆիլտրերը, Finders Technology Associates (FTA) քարտերը, պոլիէթերսուլֆոնի վրա հիմնված ֆիլտրերը և գլիկանապատ նյութերը [40, 41, 42, 43, 44]:Ծակոտկեն մանրաթելային նյութերը, ինչպիսիք են մանրաթելային թուղթը, առաջին անգամ օգտագործվել են ԴՆԹ-ի մեկուսացման համար՝ երկար շղթայված ԴՆԹ-ի մոլեկուլները մանրաթելերի հետ ֆիզիկապես խճճելու միջոցով:Փոքր ծակոտիները հանգեցնում են ԴՆԹ-ի մոլեկուլների ուժեղ ֆիզիկական սահմանափակման, ինչը դրականորեն ազդում է ԴՆԹ-ի արդյունահանման վրա:Թելքավոր թղթի տարբեր ծակոտիների չափերի պատճառով արդյունահանման արդյունավետությունը չի կարող բավարարել ԴՆԹ-ի ուժեղացման կարիքները [45, 46]:FTA քարտը առևտրային ֆիլտր թուղթ է, որն օգտագործվում է դատական ​​բժշկության ոլորտում և լայնորեն կիրառվում է մոլեկուլային ախտորոշման այլ ոլորտներում:Նմուշի մեջ բջիջների թաղանթները լուծարելու համար տարբեր քիմիական նյութերով ներծծված ցելյուլոզային ֆիլտր թղթի օգտագործման միջոցով ազատված ԴՆԹ-ն պաշտպանված է քայքայումից մինչև 2 տարի:Վերջերս ներծծված ցելյուլոզային թուղթ է մշակվել տարբեր պաթոգենների մոլեկուլային հայտնաբերման համար, այդ թվում՝ SARS-CoV-2, լեյշմանիոզ և մալարիա [47,48,49]:Մեկուսացված պլազմայում ՄԻԱՎ-ը ուղղակիորեն լիզվում է, իսկ վիրուսային նուկլեինաթթուն հարստացվում է խտանյութում ներկառուցված FTA® հոսքի թաղանթով, որը թույլ է տալիս արդյունավետ արտադրել նուկլեինաթթու [50] (նկ. 2c):FTA քարտերի միջոցով նուկլեինաթթվի հայտնաբերման հիմնական խնդիրն այն է, որ քիմիական նյութերը, ինչպիսիք են գուանիդինը և իզոպրոպանոլը, արգելակում են հետագա ուժեղացման ռեակցիաները:Այս խնդիրը լուծելու համար մենք մշակեցինք Fusion 5 chitosan-ով ձևափոխված ֆիլտր թուղթը, որը միավորում է ինչպես ԴՆԹ-ի մոլեկուլների և մանրաթելային ֆիլտրի թղթի ֆիզիկական միաձուլման առավելությունները, այնպես էլ չիտոզանով ձևափոխված միացությունների վրա ԴՆԹ-ի էլեկտրաստատիկ ադսորբցիան՝ հասնելու բարձր արդյունավետ նուկլեինաթթվի արդյունահանմանը: ..ֆիլտրի մանրաթելեր [51] (նկ. 2d):Նմանապես, Zhu et al.[52] ցուցադրել է խիտոզանով ձևափոխված PCR մեթոդ, որը հիմնված է in situ մազանոթային միկրոհեղուկ համակարգի վրա՝ Զիկա վիրուսի ՌՆԹ-ի արագ մեկուսացման և հայտնաբերման համար։Նուկլեինաթթուները կարող են կլանվել/կլանվել խառը լիզատ/ՊՇՌ միջավայրում, համապատասխանաբար, հիմնվելով խիտոզանի միացման/անջատման հատկության վրա:միացնել և անջատել», արձագանքում է pH-ին:
Ինչպես նշվեց վերևում, այս ռազմավարությունները միավորում են տարբեր պինդ փուլային նյութերի առավելությունները և բարձրացնում միկրոհեղուկներում նուկլեինաթթվի արդյունահանման արդյունավետությունը:Գործնական կիրառություններում այս նյութերի մեծ քանակությամբ օգտագործումը տնտեսական չէ, և այդ նյութերով սովորական նյութերի պատշաճ մակերևութային մշակումը կամ մակերեսային ձևափոխումը կարող է նաև պահպանել դրանց գործառույթը:Հետևաբար, ենթադրվում է, որ փորձնական ուսումնասիրությունից հետո այս ռազմավարությունների իրականացումը կարող է նվազեցնել ծախսերը:
Նուկլեինաթթվի փորձարկումը միկրոհեղուկ հարթակներում հաճախ օգտագործում է փոքր նմուշի ծավալներ (< 100 µl), հետևաբար պահանջում է թիրախային նուկլեինաթթուների ուժեղացում հատուկ զոնդերով՝ փոխակերպման ազդանշանի, որը հարմար է հոսանքով հայտնաբերման համար (օպտիկական, էլեկտրական և մագնիսական) [53, 54]։ Նուկլեինաթթվի փորձարկումը միկրոհեղուկ հարթակներում հաճախ օգտագործում է փոքր նմուշի ծավալներ (< 100 µl), հետևաբար պահանջում է թիրախային նուկլեինաթթուների ուժեղացում հատուկ զոնդերով՝ փոխակերպման ազդանշանի, որը հարմար է հոսանքով հայտնաբերման համար (օպտիկական, էլեկտրական և մագնիսական) [53, 54]։ При тестировании нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах часто используются небольшие объемы образцов (< 100 мкл), поэтому требуется амплификация целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигнал, удобный для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]. Նուկլեինաթթուները միկրոհեղուկ հարթակներում փորձարկելու ժամանակ հաճախ օգտագործվում են նմուշների փոքր ծավալներ (<100 µL), ուստի անհրաժեշտ է թիրախային նուկլեինաթթուների ուժեղացում հատուկ զոնդերով, որպեսզի այն վերածվի հետագա հայտնաբերման համար հարմար ազդանշանի (օպտիկական, էլեկտրական և մագնիսական): [53, 54]։微流控微流控 上 的 核酸 检测 通常 使用 小样本量 (<100 特定 探针 扩增 信号 (光学, 电学 和 磁学 下游 检测 (光学, 电学 和 磁学) 的 信号 [53, 54 ]։微流控 平台 上 的 核酸 检测 使用 小样本量 ((<100 μL), 因此 需要 特定 探针 扩增 目标, 以 转换 为 下游 下游 (光学 电学 磁学) 信号 [53, 54, 54, 54 ]։ Обнаружение нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах обычно использует небольшие объемы образцов (<100 мкл), что требует амплификации целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигналы для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]]. Նուկլեինաթթուների հայտնաբերումը միկրոհեղուկ հարթակներում սովորաբար օգտագործում է փոքր նմուշի ծավալներ (<100 մկլ), ինչը պահանջում է թիրախային նուկլեինաթթուների ուժեղացում հատուկ զոնդերով՝ դրանք վերածելու ազդանշանների՝ հետագա հայտնաբերման համար (օպտիկական, էլեկտրական և մագնիսական) [53, 54] .Նուկլեինաթթվի ուժեղացումը միկրոհեղուկներում կարող է նաև արագացնել ռեակցիաները, օպտիմալացնել հայտնաբերման սահմանները, նվազեցնել նմուշի պահանջները և բարելավել հայտնաբերման ճշգրտությունը [55, 56]:Վերջին տարիներին, արագ և ճշգրիտ հայտնաբերմամբ, միկրոֆլյուիդիկայի մեջ կիրառվել են նուկլեինաթթուների ուժեղացման տարբեր մեթոդներ, այդ թվում՝ ՊՇՌ և որոշ իզոթերմային ուժեղացման ռեակցիաներ։Այս բաժնում կամփոփվեն միկրոհեղուկ համակարգերի վրա հիմնված նուկլեինաթթվի հայտնաբերման մեթոդները:
ՊՇՌ-ն օրգանիզմի ԴՆԹ-ի վերարտադրության գործընթացի մոդելավորումն է, որի տեսությունը մանրամասն նկարագրված է մեկ այլ տեղ և այստեղ չի քննարկվի:PCR-ն կարող է մեծացնել թիրախային ԴՆԹ/ՌՆԹ-ի շատ փոքր քանակությունը էքսպոնենցիալ արագությամբ, ինչը PCR-ն դարձնում է հզոր գործիք նուկլեինաթթուների արագ հայտնաբերման համար:Վերջին տասնամյակների ընթացքում ստեղծվել են բազմաթիվ շարժական միկրոհեղուկ սարքեր, որոնք հագեցած են PCR ջերմային ցիկլային համակարգերով, որպեսզի բավարարեն խնամքի կետային ախտորոշման կարիքները [57, 58]:Չիպային PCR-ն կարելի է բաժանել չորս տեսակի (պայմանական, շարունակական հոսք, տարածական անջատված և կոնվեկտիվ PCR)՝ ըստ ջերմաստիճանի վերահսկման տարբեր մեթոդների [59]:Օրինակ, Gee et al.[60] մշակել է ուղղակի հակադարձ արտագրման քանակական PCR (RT-qPCR) մեթոդ իրենց սեփական միկրոհեղուկ հարթակի վրա՝ SARS-CoV-2, գրիպի A և B վիրուսների մուլտիպլեքսային հայտնաբերման համար կոկորդի շվաբրի նմուշներում (նկ. 3ա):Park et al.[61] ստեղծեց պարզ պաթոգեն վերլուծության չիպ՝ ինտեգրելով բարակ թաղանթով PCR, էլեկտրոդներ և մատով աշխատող պոլիդիմեթիլսիլոքսանի վրա հիմնված միկրոհեղուկ մոդուլ։Այնուամենայնիվ, երկու աշխատանքներն էլ ներառում են սովորական PCR-ի ընդհանուր թերությունները:ՊՇՌ-ն պահանջում է ջերմային ցիկլեր, ինչը սահմանափակում է սարքի հետագա մանրացումը և նվազեցնում փորձարկման ժամանակը:
Այս խնդիրը լուծելու համար կարևոր է շարունակական հոսքի վրա հիմնված միկրոհեղուկ և տիեզերական անջատիչ PCR-ի մշակումը:Օգտագործելով երկար օձային ալիք կամ կարճ ուղիղ կապուղի, շարունակական հոսքի PCR-ն կարող է ապահովել արագ ուժեղացում՝ ակտիվորեն շրջանառելով ռեագենտները երեք նախնական տաքացման գոտիներում անջատված պոմպով:Այս գործողությունը հաջողությամբ խուսափում է տարբեր ռեակցիաների ջերմաստիճանների միջև անցումային փուլից և այդպիսով զգալիորեն կրճատում է փորձարկման ժամանակը [62] (նկ. 3b):Յունգի և այլոց մեկ այլ ուսումնասիրության մեջ:[63] առաջարկեց նոր պտտվող PCR գենետիկ անալիզատոր, որը միավորում է ֆիքսված և հոսքային PCR-ի բնութագրերը գերարագ և մուլտիպլեքսային հակադարձ տրանսկրիպցիոն PCR-ի համար (նկ. 3c):Նուկլեինաթթվի ուժեղացման համար PCR միկրոչիպը պտտվելու է երեք տաքացնող բլոկների միջով՝ տարբեր ջերմաստիճաններում.
ՊՇՌ-ի կիրառումը միկրոֆլյուիդիկայի մեջ.dirRT-qPCR-ի սխեմատիկ ներկայացում միկրոհեղուկ հարթակի վրա (հարմարեցված է [60]-ից):b շարունակական հոսքի PCR միկրոզանգվածի սխեմատիկ ներկայացում, որը հիմնված է օձային ալիքի վրա (հարմարեցված է [62]-ից):գ Պտտվող PCR գենետիկական անալիզատորի սխեմատիկ ներկայացում, որը բաղկացած է միկրոչիպից, երեք տաքացնող բլոկից և քայլային շարժիչից (հարմարեցված է [63]-ից):դ Թերմոկոնվեկցիոն PCR-ի դիագրամ ցենտրիֆուգմամբ և տեղադրմամբ (հարմարեցված է [64]-ից):DirRT-qPCR, ուղղակի քանակական հակադարձ տրանսկրիպցիոն պոլիմերազային շղթայական ռեակցիա
Օգտագործելով մազանոթներ և օղակներ կամ նույնիսկ բարակ թիթեղներ, կոնվեկցիոն PCR-ն կարող է արագորեն ուժեղացնել նուկլեինաթթուները բնական ազատ ջերմային կոնվեկցիայի միջոցով՝ առանց արտաքին պոմպի անհրաժեշտության:Օրինակ, ցիկլային օլեֆինային պոլիմերային միկրոհեղուկ հարթակ մշակվել է պատրաստված պտտվող տաքացման փուլի վրա, որն օգտագործում է ջերմային ցիկլավորում՝ ցենտրիֆուգմամբ PCR հանգույցի միկրոալիքում [64] (նկ. 3d):Ռեակցիայի լուծույթը պայմանավորված է ջերմային կոնվեկցիայով, որն անընդհատ փոխանակում է բարձր և ցածր ջերմաստիճանը օղակաձև կառուցվածք ունեցող միկրոալիքում:Ամբողջ ուժեղացման գործընթացը կարող է ավարտվել 10 րոպեում 70,5 pg/ալիքի հայտնաբերման սահմանաչափով:
Ինչպես և սպասվում էր, արագ PCR-ը հզոր գործիք է ամբողջությամբ ինտեգրված նմուշ-արձագանքման մոլեկուլային ախտորոշման և մուլտիպլեքսային վերլուծության համակարգերի համար:Արագ PCR-ը զգալիորեն նվազեցնում է SARS-CoV-2-ի հայտնաբերման համար անհրաժեշտ ժամանակը, ինչը նպաստում է COVID-19 համաճարակի արդյունավետ վերահսկմանը։
PCR-ը պահանջում է բարդ ջերմային ցիկլեր, որը հարմար չէ POCT-ի համար:Բոլորովին վերջերս, իզոթերմային ուժեղացման մեթոդները կիրառվել են միկրոհեղուկների համար, ներառյալ, բայց չսահմանափակվելով LAMP-ով, ռեկոմբինազային պոլիմերազային ամպլիֆիկացմամբ (RPA) և նուկլեինաթթվի հաջորդականությունների վրա հիմնված ուժեղացումով [65,66,67,68]:Այս տեխնիկայի միջոցով նուկլեինաթթուները ուժեղացվում են մշտական ​​ջերմաստիճանում, ինչը հեշտացնում է ցածր գնով, բարձր զգայուն շարժական POCT սարքերի ստեղծումը մոլեկուլային ախտորոշման համար:
Բարձր թողունակության միկրոհեղուկների վրա հիմնված LAMP վերլուծությունները թույլ են տալիս բազմակի հայտնաբերել վարակիչ հիվանդությունները [42, 69, 70, 71]:Կենտրոնախույս միկրոհեղուկ համակարգի հետ համատեղ՝ LAMP-ը կարող է ավելի հեշտացնել նուկլեինաթթվի հայտնաբերման ավտոմատացումը [69, 72, 73, 74, 75]:Spin-and-react SlipChip-ը մշակվել է բազմաթիվ զուգահեռ բակտերիաների տեսողական հայտնաբերման համար՝ օգտագործելով LAMP [76] (նկ. 4ա):Վերլուծության մեջ օպտիմիզացված LAMP-ն օգտագործելիս ֆլյուորեսցենտային ազդանշան-աղմուկ հարաբերակցությունը մոտավորապես 5 անգամ էր, իսկ հայտնաբերման սահմանը հասնում էր գենոմային ԴՆԹ-ի 7,2 օրինակ/μl: Ավելին, մարսողության հինգ ընդհանուր բակտերիաների պաթոգենների, այդ թվում՝ Bacillus cereus-ի, Escherichia coli-ի, Salmonella enterica-ի, Vibrio fluvialis-ի և Vibrio parahaemolyticus-ի առկայությունը մեթոդի հիման վրա տեսանելի է եղել <60 րոպեում: Ավելին, մարսողության հինգ ընդհանուր բակտերիաների պաթոգենների, այդ թվում՝ Bacillus cereus-ի, Escherichia coli-ի, Salmonella enterica-ի, Vibrio fluvialis-ի և Vibrio parahaemolyticus-ի առկայությունը մեթոդի հիման վրա տեսանելի է եղել <60 րոպեում:Ավելին, մարսողական տրակտի հինգ ընդհանուր բակտերիալ պաթոգենների առկայությունը՝ ներառյալ Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis և Vibrio parahaemolyticus, տեսանելի է այս մեթոդի միջոցով 60 րոպեից պակաս ժամանակում:此外, 基于 该 方法 在 了 的 存在, 包括 蜡状 芽孢杆菌, 大肠杆菌 肠 氏 菌, 河流 弧菌 沙门 氏 菌:此外, 基于 该 方法 在 <60 分钟分钟 消化道 了 的 存在, 包括 芽孢杆菌, 大肠杆菌, 肠 氏 菌 性 ... 弧菌 弧菌 弧菌弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 HIPԲացի այդ, հինգ ընդհանուր բակտերիաների ստամոքս-աղիքային պաթոգենների առկայությունը, ներառյալ Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvius և Vibrio parahaemolyticus, տեսանելի է այս մեթոդի միջոցով 60 րոպեից պակաս ժամանակում:
LAMP-ի առավելությունները միկրոհեղուկների մեջ ներառում են, ի թիվս այլոց, արագ արձագանքման և մանրացված հայտնաբերման:Այնուամենայնիվ, ռեակցիայի ջերմաստիճանի պատճառով (մոտ 70°C), LAMP-ի ընթացքում աերոզոլները անխուսափելիորեն առաջանում են, ինչը հանգեցնում է կեղծ դրական բարձր արագության:Փորձարկման առանձնահատկությունը, այբբենարանի ձևավորումը և ջերմաստիճանի վերահսկումը նույնպես պետք է օպտիմալացվեն LAMP-ի համար:Բացի այդ, չիպերի նախագծերը, որոնք իրականացնում են մի քանի թիրախների հայտնաբերում մեկ չիպի վրա, մեծ արժեք ունեն և պետք է մշակվեն:Բացի այդ, LAMP-ը հարմար է մեկ չիպի մեջ ինտեգրված բազմաֆունկցիոնալ հայտնաբերման համար, ինչը մեծ նշանակություն ունի, բայց զարգացման համար դեռ շատ տեղ կա։
LAMP-ի բարձր կեղծ դրական դրույքաչափը կարող է մասամբ կրճատվել RPA-ով, քանի որ ռեակցիայի համեմատաբար ցածր ջերմաստիճանը (~37 °C) հանգեցնում է գոլորշիացման համեմատաբար քիչ խնդիրների [77]:RPA համակարգում երկու հակադիր պրայմերները սկսում են ԴՆԹ-ի սինթեզը՝ կապվելով ռեկոմբինազի հետ և ուժեղացումը կարող է ավարտվել 10 րոպեի ընթացքում [78,79,80,81]:Հետեւաբար ՀՀԿ-ի ողջ գործընթացը շատ ավելի արագ է ընթանում, քան PCR-ը կամ LAMP-ը։Վերջին տարիներին ցուցադրվել է, որ միկրոհեղուկ տեխնոլոգիան էլ ավելի է բարելավում RPA-ի արագությունն ու ճշգրտությունը [82,83,84]:Օրինակ, Liu et al.[85] մշակել է միկրոհեղուկ ինտեգրված կողային հոսքի պոլիմերազային ռեկոմբինազի ուժեղացման փորձարկում SARS-CoV-2-ի արագ և զգայուն հայտնաբերման համար՝ ինտեգրելով հակադարձ տառադարձման RPA-ն (RT-RPA) և ունիվերսալ կողային հոսքի թեստային շերտի հայտնաբերման համակարգը:մեկ միկրոհեղուկ համակարգի մեջ:Նկար 4 բ):Հայտնաբերման սահմանաչափը 1 օրինակ/µl կամ 30 օրինակ/նմուշ է, և հայտնաբերումը կարող է ավարտվել մոտ 30 րոպեում:Կոնգ և այլք։մշակել են կրելի միկրոհեղուկ սարք։[86] օգտագործեց մարմնի ջերմաստիճանը և բջջային հեռախոսի վրա հիմնված ֆլուորեսցենտային հայտնաբերման համակարգ՝ ՄԻԱՎ-1 ԴՆԹ-ն արագ և ուղղակիորեն հայտնաբերելու համար RPA-ի միջոցով (Նկար 4c):Հագվող RPA վերլուծությունը հայտնաբերում է թիրախային հաջորդականության 100 օրինակ/մլ 24 րոպեի ընթացքում՝ ցույց տալով մեծ ներուժ ՄԻԱՎ-1-ով վարակված նորածինների արագ ախտորոշման համար ռեսուրսներով սահմանափակ պայմաններում:
Իզոթերմային ուժեղացում խնամքի կետում (POCT):Սփինի և ռեակցիայի SlipChip-ի մշակում և արտադրություն:Պլազմային եռակցումից հետո վերին և ներքևի չիպսերը հավաքվել են մի շարք ընկույզներով, որպեսզի ձևավորվի վերջնական չիպը (հարմարեցված է [76]-ից):b COVID-19-ի հայտնաբերման MI-IF-RPA համակարգի սխեման (հարմարեցված է [85]-ից):գ ՄԻԱՎ-1 ԴՆԹ-ի արագ հայտնաբերման համար կրելի RPA թեստի սխեման (հարմարեցված է [86]-ից):SE Salmonella enterica, VF Vibrio fluvius, VP Vibrio parahaemolyticus, BC Bacillus cereus, EC Escherichia coli, FAM carboxyfluorescein, մարդու իմունային անբավարարության վիրուս ՄԻԱՎ, RPA ռեկոմբինազային պոլիմերազային ամպլիֆիկացիա, LED լուսադիոդ, MI-IFL-ի ինտեգրալազա, MI-IF-R. Ուժեղացում
Microfluidic-ի վրա հիմնված ՀՀԿ-ն արագ զարգանում է, սակայն չիպերի արտադրության և ռեակցիայի սպառման արժեքը չափազանց բարձր է և պետք է կրճատվի այս տեխնոլոգիայի հասանելիությունը մեծացնելու համար:Բացի այդ, ՀՀԿ-ի բարձր զգայունությունը կարող է ազդել ոչ հատուկ արտադրանքի ուժեղացման վրա, հատկապես աղտոտման առկայության դեպքում:Այս սահմանափակումները կարող են ազդել RPA-ի կիրառման վրա միկրոհեղուկ համակարգերում և արժանի լինել հետագա օպտիմալացման:Տարբեր թիրախների համար լավ մշակված այբբենարաններ և զոնդեր նույնպես անհրաժեշտ են՝ POCT-ում ՀՀԿ-ի վրա հիմնված միկրոհեղուկային ռազմավարությունների իրագործելիությունը բարելավելու համար:
Cas13-ը և Cas12a-ն ունեն նուկլեինաթթուները պատահականորեն ճեղքելու ունակություն և այդպիսով կարող են մշակվել որպես հայտնաբերման և ախտորոշման գործիքներ:Cas13-ը և Cas12a-ն ակտիվանում են համապատասխանաբար թիրախային ԴՆԹ-ին կամ ՌՆԹ-ին միանալուց հետո:Ակտիվացումից հետո սպիտակուցը սկսում է ճեղքել մոտակա այլ նուկլեինաթթուներ, որից հետո ուղղորդող ՌՆԹ-ները, որոնք ուղղված են պաթոգեն հատուկ նուկլեինաթթուներին, կարող են ճեղքել հանգցված լյումինեսցենտային զոնդերը և արձակել ֆլյուորեսցենտ:Այս տեսության հիման վրա Kellner et al.[87] մշակել է Cas13-ի վրա հիմնված մեթոդ [Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKING (SHERLOCK)], և Broughton et al.[88] մշակեց մեկ այլ մոտեցում՝ հիմնված Cas12a-ի վրա [CRISPR Trans Reporter targeting DNA endonuclease (DTECR)]:
Վերջին տարիներին ի հայտ են եկել CRISPR-ի հիման վրա նուկլեինաթթուների հայտնաբերման տարբեր մեթոդներ [89, 90]:CRISPR-ի վրա հիմնված ավանդական մեթոդները հաճախ ժամանակատար և աշխատատար են բազմաթիվ պրոցեդուրաների պատճառով, ներառյալ նուկլեինաթթվի արդյունահանումը, ուժեղացումը և CRISPR հայտնաբերումը:Հեղուկների օդի ազդեցությունը կարող է մեծացնել կեղծ դրական արդյունքների հավանականությունը:Հաշվի առնելով վերը նշվածը, CRISPR-ի վրա հիմնված համակարգերը օպտիմալացման խիստ կարիք ունեն:
CRISPR-Cas12a և CRISPR-Cas13a հայտնաբերման հավելվածների համար մշակվել է օդաճնշական կառավարվող միկրոհեղուկ հարթակ, որը կարող է կատարել 24 անալիզ զուգահեռաբար [91]:Համակարգը հագեցած է ֆլյուորեսցենտային հայտնաբերման սարքով, որը շրջանցում է նուկլեինաթթվի ուժեղացումը և ավտոմատ կերպով հայտնաբերում ֆեմտոմոլային ԴՆԹ-ի և ՌՆԹ-ի նմուշները:Chen et al.[92] ինտեգրված ռեկոմբինազային ուժեղացում CRISPR-Cas12a համակարգով կենտրոնախույս միկրոհեղուկներում (նկ. 5ա):Այս աշխատանքը հաղթահարում է այս երկու գործընթացների ինտեգրման դժվարությունը, քանի որ Cas12a-ն կարող է մարսել սուրհանդակի ԴՆԹ-ն և արգելակել ուժեղացման գործընթացը:Բացի այդ, Chen et al.[92] հավելյալ նախապես պահեց ռեակցիայի ռեակտիվները կենտրոնախույս միկրոհեղուկ հսկողության մեջ՝ ամբողջ գործընթացը ավտոմատ կերպով ավարտելու համար։Մեկ այլ աշխատության մեջ Սիլվան և այլք.[93] մշակել է ախտորոշման մեթոդ առանց CRISPR/Cas12a ուժեղացման և սմարթֆոնի՝ SARS-CoV-2-ը հայտնաբերելու համար (նկ. 5b):Այս վերլուծությունը, որը հայտնի է որպես բջջային հեռախոսի վրա հիմնված ուժեղացումից զերծ համակարգ, ներառում է CRISPR/Cas-կախված ֆերմենտ, որը հիմնված է միկրոհեղուկ ալիքներում կատալազի գեներացվող պղպջակների ազդանշանների սմարթֆոնի պատկերացման վրա:Նուկլեինաթթվի 50 օրինակ/մլ-ից պակաս զգայուն հայտնաբերում առանց նախնական ուժեղացման, նմուշի ներարկումից մինչև ազդանշանի ընթերցման ողջ գործընթացը տևում է ընդամենը 71 րոպե:
Նուկլեինաթթվի հայտնաբերման մեթոդներ՝ հիմնված CRISPR-ի վրա:Կենտրոնախույս POCT՝ CRISPR-ի վրա հիմնված ինտեգրված մոլեկուլային ախտորոշման համար (հարմարեցված է [92]-ից):b SARS-CoV-2-ի սմարթֆոնների վրա հիմնված վերլուծության համար CASCADE թեստի մշակում (հարմարեցված է [93]-ից):RAA ռեկոմբինազային ամպլիֆիկացում, PAM հարակից պրոտոտարածքի մոտիվ, CRISPR կլաստերային կարճ պալինդրոմային կրկնություններ կանոնավոր պարբերականությամբ, CASCADE համակարգ առանց բջջային հեռախոսի ուժեղացման CRISPR/CAS-կախյալ ֆերմենտներով, 1-էթիլ-3-[3-դիմեթիլամինոպրոպիլ]կարբոդիիմիդ EDC հիդրոքլորիդ:
Որպես նուկլեինաթթվի հայտնաբերման վերջին քայլ, ազդանշանի հայտնաբերումն ուղղակիորեն արտացոլում է ախտորոշման արդյունքները և կարևոր գործոն է արդյունավետ, զգայուն և ճշգրիտ POCT-ի ստեղծման համար:Ազդանշանները կարելի է կարդալ՝ օգտագործելով տարբեր մեթոդներ, ինչպիսիք են լյումինեսցենտային, էլեկտրաքիմիական, գունաչափական և մագնիսական ռազմավարությունները:Այս բաժնում մենք նկարագրում ենք յուրաքանչյուր մոտեցման հիմնավորումը և համեմատում միկրոհեղուկի վարակիչ հիվանդությունների մոլեկուլային ախտորոշումը:
Ֆլյուորեսցենցիայի վրա հիմնված ռազմավարությունները լայնորեն օգտագործվում են վարակիչ հիվանդությունների POCT ախտորոշման համար՝ շնորհիվ իրենց ուշագրավ առավելությունների՝ գերազանց զգայունության, ցածր գնի, շահագործման հեշտության և խնամքի կետի վերլուծության [94, 95]:Այս ռազմավարություններում օգտագործվում են պիտակավորված ֆտորոֆորներ, ինչպիսիք են լյումինեսցենտային ներկերը և նանոնյութերը՝ հայտնաբերելի ազդանշան ստեղծելու համար (ֆլուորեսցենցիայի ուժեղացում կամ մարում):Այս բացահայտումը ցույց է տալիս, որ ֆլուորեսցենտային վրա հիմնված ռազմավարությունները կարելի է բաժանել ուղղակի լյումինեսցենտային պիտակավորման, ազդանշանի միացման և ազդանշանի անջատման ֆլուորեսցենտային հայտնաբերման [96]:Ուղղակի լյումինեսցենտային պիտակների հայտնաբերումը օգտագործում է հատուկ լյումինեսցենտային պիտակներ՝ հատուկ լիգանդներ պիտակավորելու համար, որոնք որոշակի քանակությամբ ֆլյուորեսցենտ են առաջացնում, երբ ընտրողաբար կապված են թիրախին:Ազդանշանի վրա հիմնված ֆլուորեսցենտային հայտնաբերման համար լյումինեսցենտային ազդանշանի որակը դրականորեն կապված է հետաքրքրության մեծության հետ:Լյումինեսցենցիայի ինտենսիվությունը աննշան է թիրախի բացակայության դեպքում և նկատելի է, երբ առկա է թիրախի բավարար քանակություն:Ընդհակառակը, «ազդանշանի անջատման» ֆլուորեսցենտով հայտնաբերված ֆլուորեսցենցիայի ինտենսիվությունը հակադարձ համեմատական ​​է թիրախի քանակին, սկզբում հասնում է առավելագույն արժեքի և աստիճանաբար նվազում է, երբ թիրախը մեծանում է:Օրինակ, օգտագործելով CRISPR-Cas13a թիրախից կախված տրանս-հատման մեխանիզմը, Tian et al.[97] մշակել է ճանաչման նոր ռազմավարություն՝ հայտնաբերելու ՌՆԹ-ները, որոնք ուղղակիորեն շրջանցում են հակադարձ տրանսկրիպցիան (նկ. 6ա):Կոմպլեմենտար թիրախային ՌՆԹ-ներին միանալուց հետո CRISPR-Cas13-RNA համալիրը կարող է ակտիվանալ՝ առաջացնելով տրանսգրավային ճեղքվածք ոչ սպեցիֆիկ ռեպորտաժային ՌՆԹ-ների կողմից:Լյումինեսցենտով պիտակավորված ռեպորտորը [ֆտորոֆոր (F)] մարվում է հանգցիչով (Q) անփոփոխ և ֆլյուորեսցվում է, երբ ճեղքվում է ակտիվացված կոմպլեքսով:
Էլեկտրաքիմիական հայտնաբերման առավելությունը բարձր հայտնաբերման արագությունն է, հեշտ արտադրությունը, ցածր արժեքը, հեշտ տեղափոխումը և ավտոմատ կառավարումը:Այն հզոր վերլուծական մեթոդ է POCT հավելվածների համար:Գրաֆենի դաշտային ազդեցության տրանզիստորների հիման վրա Gao et al.[98] մշակել է նանոբիոսենսոր՝ Borrelia burgdorferi բակտերիայից Լայմի հիվանդության անտիգենների մուլտիպլեքսային հայտնաբերման համար՝ 2 պգ/մլ հայտնաբերման սահմանաչափով (նկ. 6b):
Գունաչափական անալիզները օգտագործվել են POCT հավելվածներում՝ օգտվելով դյուրատարության, ցածր գնի, պատրաստման հեշտության և տեսողական ընթերցման առավելություններից:Գույնիմետրիկ հայտնաբերումը կարող է օգտագործել պերօքսիդազի կամ պերօքսիդազի նման նանոնյութերի օքսիդացումը, նանոնյութերի ագրեգացումը և ցուցիչ ներկերի ավելացումը թիրախ նուկլեինաթթուների առկայության մասին տեղեկատվությունը տեսանելի գունային փոփոխությունների փոխակերպելու համար [99, 100, 101]:Հատկանշական է, որ ոսկու նանոմասնիկները լայնորեն օգտագործվում են գունաչափական ռազմավարությունների մշակման մեջ, և գունային արագ և էական փոփոխություններ առաջացնելու նրանց ունակության շնորհիվ աճում է հետաքրքրությունը վարակիչ հիվանդությունների in situ ախտորոշման համար POCT գունաչափական հարթակների մշակման նկատմամբ [102]:Ինտեգրված կենտրոնախույս միկրոհեղուկ սարքի միջոցով [103], աղտոտված կաթի նմուշներում սննդային պաթոգենները կարող են ավտոմատ կերպով հայտնաբերել 10 բակտերիաների բջիջների մակարդակով, և արդյունքները տեսողականորեն կարդալ 65 րոպեի ընթացքում (նկ. 6c):
Մագնիսական զգայական տեխնիկան կարող է ճշգրիտ հայտնաբերել անալիտները՝ օգտագործելով մագնիսական նյութեր, և վերջին տասնամյակների ընթացքում զգալի հետաքրքրություն է նկատվել POCT կիրառությունների նկատմամբ:Մագնիսական զգայության տեխնիկան ունի մի քանի եզակի առավելություններ, ինչպիսիք են էժան մագնիսական նյութերը, այլ ոչ թե թանկարժեք օպտիկական բաղադրիչները:Այնուամենայնիվ, մագնիսական դաշտի օգտագործումը բարելավում է հայտնաբերման արդյունավետությունը և նվազեցնում նմուշի պատրաստման ժամանակը [104]:Բացի այդ, մագնիսական զոնդավորման արդյունքները ցույց են տալիս բարձր սպեցիֆիկություն, զգայունություն և ազդանշան-աղմուկ բարձր հարաբերակցություն՝ կենսաբանական նմուշների աննշան մագնիսական ֆոնային ազդանշանի պատճառով [105]:Sharma et al.ինտեգրվել է մագնիսական թունելի հանգույցի վրա հիմնված բիոսենսորը շարժական միկրոչիպի հարթակի մեջ:[106] պաթոգենների մուլտիպլեքսային հայտնաբերման համար (նկ. 6d):Բիոսենսորները զգայուն կերպով հայտնաբերում են պաթոգեններից մեկուսացված ենթանոմոլային նուկլեինաթթուները:
Ազդանշանի հայտնաբերման բնորոշ մեթոդ.Cas13a-ի հիպերլոկալիզացված հայտնաբերման հայեցակարգը (հարմարեցված է [97]-ից):b Գրաֆենի նանոբիոսենսոր FET-ը Lyme GroES scFv-ի հետ համատեղ (հարմարեցված է [98]-ից):գ կենտրոնախույս միկրոհեղուկ չիպի մեջ սննդամթերքով փոխանցվող պաթոգենների մուլտիպլեքսային հայտնաբերման գունաչափական ցուցումներ. թիվ 1 և թիվ 3 նմուշներ թիրախային պաթոգեններով և թիվ 2, թիվ 4 և թիվ 5 նմուշներ առանց թիրախային պաթոգենների (հարմարեցված է [103]-ից): .դ Կենսենսոր, որը հիմնված է մագնիսական թունելի հանգույցի վրա, ներառյալ հարթակը, ներկառուցված արգելափակող ուժեղացուցիչը, կառավարման միավորը և ազդանշանի ստեղծման/ստացման էլեկտրամատակարարումը (հարմարեցված է [106]-ից):GFET Գրաֆեն FET, Escherichia coli, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, PC PC, PDMS Dimethicone, PMMA polymethyl methacrylate
Չնայած վերը նշված հայտնաբերման մեթոդների գերազանց բնութագրերին, դրանք դեռևս ունեն թերություններ:Այս մեթոդները համեմատվում են (Աղյուսակ 1), ներառյալ որոշ հավելվածներ մանրամասներով (կողմ և դեմ):
Միկրոհեղուկների, միկրոէլեկտրամեխանիկական համակարգերի, նանոտեխնոլոգիաների և նյութերագիտության զարգացման հետ մեկտեղ միկրոհեղուկ չիպերի օգտագործումը վարակիչ հիվանդությունների հայտնաբերման համար մշտապես զարգանում է [55,96,107,108]:Մանրանկարչական սարքավորումների և հեղուկների ճշգրիտ մանիպուլյացիաները նպաստում են ախտորոշման ճշգրտությանը և ծախսարդյունավետությանը:Հետևաբար, հետագա զարգացման համար ջանքեր են գործադրվել չիպերի օպտիմալացման և արդիականացման ուղղությամբ, ինչի արդյունքում ստեղծվել են տարբեր կառուցվածքով և գործառույթներով տարբեր միկրոհեղուկ չիպեր:Այստեղ մենք հակիրճ ներկայացնում ենք միկրոհեղուկ հարթակների մի քանի սովորական տեսակներ և համեմատում դրանց բնութագրերը (կողմ և դեմ):Բացի այդ, ստորև թվարկված օրինակների մեծ մասը հիմնականում կենտրոնանում է SARS-CoV-2-ի դեմ պայքարի վրա:
LOCC-ները ամենատարածված մանրացված բարդ վերլուծական համակարգերն են, և դրանց գործողությունները խիստ մանրացված են, ինտեգրված, ավտոմատացված և զուգահեռացված են նմուշների ներարկման և պատրաստման, հոսքի վերահսկման և հեղուկի հայտնաբերման հետ [109, 110]:Հեղուկները մանիպուլյացիայի են ենթարկվում մանրակրկիտ ձևավորված երկրաչափության և բազմաթիվ ֆիզիկական էֆեկտների փոխազդեցության միջոցով, ինչպիսիք են ճնշման գրադիենտները, մազանոթային գործողությունը, էլեկտրադինամիկան, մագնիսական դաշտերը և ձայնային ալիքները [111]:LOCC-ը ցույց է տալիս գերազանց առավելություններ բարձր թողունակության զննման և բազմակի հայտնաբերման մեջ՝ արագ վերլուծության արագությամբ, փոքր նմուշի չափով, ցածր էներգիայի սպառմամբ և կառավարման և շահագործման բարձր արդյունավետությամբ;Այնուամենայնիվ, LOCC սարքերը շատ նուրբ են և արտադրվում են, փաթեթավորվում և փոխկապակցված են:Այնուամենայնիվ, մուլտիպլեքսավորումը և վերօգտագործումը բախվում են հսկայական դժվարությունների [96]:Համեմատած այլ հարթակների հետ՝ LOCC-ն ունի եզակի առավելություններ՝ առավելագույն կիրառական բազմազանության և լավագույն տեխնոլոգիական համատեղելիության առումով, սակայն դրա թերությունները նույնպես ակնհայտ են, այն է՝ բարձր բարդությունը և վատ կրկնելիությունը:Արտաքին պոմպերից կախվածությունը, որոնք հաճախ ծավալուն և թանկ են, ավելի է սահմանափակում դրանց օգտագործումը POCT-ում:
COVID-19-ի բռնկման ժամանակ LOCC-ն մեծ ուշադրության արժանացավ։Միաժամանակ կան մի քանի նոր չիպեր, որոնք միավորում են մի քանի տեխնոլոգիաներ։Օրինակ՝ սմարթֆոններն այժմ լայնորեն օգտագործվում են որպես շարժական վերլուծական սարքեր և ունեն LOCC ինտեգրման մեծ ներուժ:Sun et al.[21] արտադրել է միկրոհեղուկ չիպ, որը թույլ է տալիս մուլտիպլեքսավորել հինգ պաթոգենների հատուկ նուկլեինաթթուների հաջորդականությունը, ներառյալ SARS-CoV-2-ը, օգտագործելով LAMP և վերլուծել դրանք սմարթֆոնի միջոցով ռեակցիայի ավարտից հետո 1 ժամվա ընթացքում:Որպես մեկ այլ օրինակ, Սունդահը և այլք.[112] ստեղծեց մոլեկուլային անջատիչ [կատալիտիկ ուժեղացում մոլեկուլային անցումային վիճակի անջատիչով (CATCH)]՝ սմարթֆոնների միջոցով SARS-CoV-2 ՌՆԹ թիրախների ուղղակի և զգայուն հայտնաբերման համար: CATCH-ը համատեղելի է շարժական LOCC-ի հետ և ապահովում է բարձր արդյունավետություն (մոտավորապես 8 ՌՆԹ պատճեն/մլ; < 1 ժամ սենյակային ջերմաստիճանում) [112]: CATCH-ը համատեղելի է շարժական LOCC-ի հետ և ապահովում է բարձր արդյունավետություն (մոտավորապես 8 ՌՆԹ պատճեն/մլ; < 1 ժամ սենյակային ջերմաստիճանում) [112]: CATCH совместим с портативным LOCC и обеспечивает превосходную производительность (օրինակ 8 копий РНК/мкл; < 1 ч при комнатной температура) [112]: CATCH-ը համատեղելի է շարժական LOCC-ի հետ և ապահովում է գերազանց թողունակություն (մոտավորապես 8 ՌՆԹ պատճեն/µl; < 1 ժամ սենյակային ջերմաստիճանում) [112]: CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 小时]〧 112） CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 小时]〧 112） CATCH совместим со портативными LOCC и обладает превосходной производительностью (օրինակ 8 копий РНК/мкл; < 1 часа при комнатной температура) [112]: CATCH-ը համատեղելի է շարժական LOCC-ների հետ և ունի գերազանց կատարողականություն (մոտ 8 ՌՆԹ պատճեն/մլ; < 1 ժամ սենյակային ջերմաստիճանում) [112]:Բացի այդ, մոլեկուլային ախտորոշման համար նախատեսված LOCC սարքերը նաև օգտագործում են որոշ շարժիչ ուժեր, ինչպիսիք են վակուումը, ձգումը և էլեկտրական դաշտերը:Kang et al.[113] ցուցադրել է իրական ժամանակի, գերարագ նանոպլազմա-չիպի ​​վրա PCR՝ դաշտում COVID-19-ի արագ և քանակական ախտորոշման համար՝ օգտագործելով վակուումային պլազմոնիկ հեղուկ PCR չիպ:Լի et al.[114] այնուհետև մշակեց ձգվող միկրոհեղուկ չիպ, որը հնարավորություն տվեց ախտորոշել COVID-19-ը:Պլատֆորմն օգտագործում է RT-LAMP ուժեղացման համակարգը՝ որոշելու, թե արդյոք նմուշը որակապես դրական է, թե բացասական:Հետագայում Ռամաչանդրան և այլք.[115] հասավ էլեկտրական դաշտի համապատասխան գրադիենտների՝ օգտագործելով isotachophoresis (ITP)՝ իոնային կենտրոնացման ընտրովի տեխնիկա, որն իրականացվում է միկրոհեղուկների մեջ։ITP-ի միջոցով թիրախ ՌՆԹ-ն քիթ-կոկորդային շվաբրի չմշակված նմուշներից կարող է ավտոմատ կերպով մաքրվել:Այնուհետեւ Ռամաչանդրան եւ այլք.[115] Այս ITP մաքրումը համատեղելով ITP-ով ուժեղացված LAMP-ի և CRISPR վերլուծությունների հետ, մոտ 35 րոպեում հայտնաբերվեց SARS-CoV-2 մարդու քիթ-կոկորդային շվաբրում և կլինիկական նմուշներում:Բացի այդ, անընդհատ նոր գաղափարներ են ի հայտ գալիս։Ջադհավը և այլք։[116] առաջարկել է ախտորոշիչ սխեմա, որը հիմնված է մակերեսի բարելավված Raman սպեկտրոսկոպիայի վրա՝ միկրոհեղուկ սարքի հետ համատեղ, որը պարունակում է կամ ուղղահայաց կողմնորոշված ​​ոսկի/արծաթով պատված ածխածնային նանոխողովակներ կամ մեկանգամյա էլեկտրամանված միկրո/նանոխողովակներ:Մեմբրանային ֆունկցիոնալ ներկառուցված ֆիլտրի միկրոալիքները մեկանգամյա օգտագործման են:Սարքը կլանում է վիրուսները մարմնի տարբեր հեղուկներից/արտանետումներից, ինչպիսիք են թուքը, քիթ-կոկորդը և արցունքները:Այսպիսով, վիրուսի տիտրը առատ է, և վիրուսը կարող է ճշգրիտ նույնականացվել Raman ստորագրությամբ:
LOAD-ը կենտրոնախույս միկրոհեղուկ հարթակ է, որտեղ բոլոր գործընթացները վերահսկվում են հաճախականության արձանագրությամբ, որը պտտում է միկրոկառուցվածքային ենթաշերտը [110]:LOAD սարքը բնութագրվում է կենտրոնախույս ուժի կիրառմամբ՝ որպես կարևոր շարժիչ ուժ։Հեղուկները նույնպես ենթարկվում են մազանոթային, էյլերի և կորիոլսի ուժերին։Օգտագործելով ցենտրիֆուգային սարքը, անալիզները կատարվում են հեղուկի շարունակական գործողությամբ՝ շառավղային ներսից դեպի արտաքին դիրք՝ վերացնելով լրացուցիչ արտաքին խողովակների, պոմպերի, ակտուատորների և ակտիվ փականների անհրաժեշտությունը:Մի խոսքով, կառավարման մեկ մեթոդը հեշտացնում է աշխատանքը:Հեղուկի վրա ազդող ուժերը նույն միկրոհեղուկ ալիքում բեռնվածքի կենտրոնից նույն հեռավորության վրա հավասար են, ինչը հնարավորություն է տալիս կրկնել կապուղու կառուցվածքը։Այսպիսով, LOAD սարքավորումն ավելի պարզ և խնայող է նախագծման և արտադրության մեջ, քան սովորական LOCC սարքավորումը, մինչդեռ ռեակցիաները հիմնականում անկախ են և զուգահեռաբար:Այնուամենայնիվ, կենտրոնախույս սարքավորումների բարձր մեխանիկական ուժի պատճառով հասանելի չիպային նյութը սահմանափակ է, իսկ փոքր ծավալները՝ դժվար:մեքենային։Միևնույն ժամանակ, LOAD սարքերի մեծ մասը նախատեսված է միայն մեկ օգտագործման համար, ինչը թանկ է լայնածավալ հայտնաբերման համար [96, 117, 118, 119]:
Վերջին տասնամյակների ընթացքում LOAD-ը, որը համարվում է ամենախոստումնալից միկրոհեղուկ սարքերից մեկը, արժանացել է հետազոտողների և արտադրողների զգալի ուշադրությանը:Այսպիսով, LOAD-ը լայն ընդունելություն է ձեռք բերել և օգտագործվել է վարակիչ պաթոգենների մոլեկուլային ախտորոշման համար [120, 121, 122, 123, 124], հատկապես COVID-19-ի բռնկման ժամանակ։Օրինակ, 2020 թվականի վերջին Ջի և այլք.[60] ցուցադրել է ուղղակի RT-qPCR անալիզ՝ SARS-CoV-2-ի և գրիպի A և B վարակների արագ և ավտոմատացված զուգահեռ հայտնաբերման համար կոկորդի շվաբրի նմուշներում:Այնուհետև Սիոնգը և այլք:[74] ներկայացրել է LAMP-ում ինտեգրված դիսկոիդ միկրոհեղուկ հարթակ՝ մարդու յոթ շնչառական վիրուսների, այդ թվում՝ SARS-CoV-2-ի արագ, ճշգրիտ և միաժամանակյա հայտնաբերման համար 40 րոպեի ընթացքում:2021 թվականի սկզբին դե Օլիվեյրան և այլք.[73] ցուցադրել է պոլիստիրոլի տոներային կենտրոնախույս միկրոհեղուկ չիպը, որը ձեռքով աշխատում է մատի ծայրի պտույտով, COVID-19-ի RT-LAMP մոլեկուլային ախտորոշման համար:Այնուհետև, Դիգնանը և այլք.[39] ներկայացրել է ավտոմատացված շարժական ցենտրիֆուգային միկրոսարք՝ SARS-CoV-2 ՌՆԹ-ի մաքրման համար անմիջապես բուկալային շվաբրի հատվածներից:Մեդվեդ և այլք:[53] առաջարկել է SARS-CoV-2 աերոզոլային նմուշառման ներկառուցված համակարգ՝ փոքր ծավալով պտտվող միկրոհեղուկ լյումինեսցենտային չիպով, 10 օրինակ/մլ հայտնաբերման սահմանաչափով և 15 րոպե ցիկլի նվազագույն շեմով:Սուարեսը և այլք:[75] վերջերս զեկուցել է ինտեգրված մոդուլային կենտրոնախույս միկրոհեղուկ հարթակի մշակման մասին SARS-CoV-2 ՌՆԹ-ի ուղղակի հայտնաբերման համար ջերմային անակտիվացված քթանցքային շվաբրի նմուշներում՝ օգտագործելով LAMP:Այս օրինակները ցույց են տալիս LOAD-ի մեծ օգուտներն ու խոստումը COVID-19-ի մոլեկուլային ախտորոշման մեջ։
1945 թվականին Մյուլլերը և Քլեգը [125] առաջին անգամ ներկայացրեցին միկրոհեղուկ ալիքները թղթի վրա՝ օգտագործելով զտիչ թուղթ և պարաֆին։2007 թվականին Whitesides խումբը [126] ստեղծեց առաջին ֆունկցիոնալ թղթային հարթակը սպիտակուցի և գլյուկոզայի փորձարկման համար։Թուղթն իդեալական ենթաշերտ է դարձել միկրոհեղուկների համար:Թուղթն ունի բնորոշ հատկություններ, ինչպիսիք են հիդրոֆիլությունը և ծակոտկեն կառուցվածքը, գերազանց կենսահամատեղելիությունը, թեթև քաշը, ճկունությունը, ծալովիությունը, ցածր արժեքը, օգտագործման հեշտությունը և հարմարավետությունը:Դասական µPAD-ները բաղկացած են հիդրոֆիլ/հիդրոֆոբ կառուցվածքներից, որոնք կառուցված են թղթե ենթաշերտերի վրա:Կախված եռաչափ կառուցվածքից, μPAD-ները կարելի է բաժանել երկչափ (2D) և եռաչափ (3D) μPAD-ների:2D µPAD-ները արտադրվում են հիդրոֆոբ սահմաններ ձևավորելով միկրոհեղուկ ալիքներ ձևավորելու համար, մինչդեռ 3D µPAD-ները սովորաբար պատրաստվում են 2D միկրոհեղուկ թղթի շերտերից, երբեմն թղթի ծալման, սայթաքման տեխնիկայի, բաց ալիքների և 3D տպագրության միջոցով [96]:μPAD-ի վրա գտնվող ջրային կամ կենսաբանական հեղուկները հիմնականում վերահսկվում են մազանոթային ուժի միջոցով՝ առանց արտաքին էներգիայի աղբյուրի, ինչը հեշտացնում է ռեակտիվների նախնական պահպանումը, նմուշների մշակումը և մուլտիպլեքսային հայտնաբերումը:Այնուամենայնիվ, հոսքի ճշգրիտ վերահսկումը և մուլտիպլեքսային հայտնաբերումը խոչընդոտվում են հայտնաբերման անբավարար արագության, զգայունության և կրկնակի օգտագործման պատճառով [96, 127, 128, 129, 130]:
Որպես անսովոր միկրոհեղուկ հարթակ, μPAD-ը լայնորեն տարածվել և մշակվել է վարակիչ հիվանդությունների մոլեկուլային ախտորոշման համար, ինչպիսիք են HCV-ն, ՄԻԱՎ-ը և SARS-CoV-2-ը [131, 132]:HCV-ի ընտրովի և զգայուն հայտնաբերման համար Tengam et al.[133] մշակել է նոր կենսասենսոր, որը հիմնված է լյումինեսցենտային թղթի վրա՝ օգտագործելով բարձր սպեցիֆիկ նուկլեինաթթվի զոնդ՝ հիմնված պիրոլիդինիլ պեպտիդի վրա։Նուկլեինաթթուները կովալենտորեն անշարժացվում են մասամբ օքսիդացված ցելյուլոզային թղթի վրա ամինախմբերի և ալդեհիդային խմբերի միջև ռեդուկտիվ ալկիլացման միջոցով, և հայտնաբերումը հիմնված է ֆլուորեսցենտության վրա:Այս ազդանշանները կարող են կարդալ հատուկ պատրաստված գաջեթը՝ շարժական լյումինեսցենտային տեսախցիկով՝ բջջային հեռախոսի տեսախցիկի հետ համատեղ:Հետագայում, Lu et al.[134] նախագծել է թղթի վրա հիմնված ճկուն էլեկտրոդ, որը հիմնված է նիկելի/ոսկու նանոմասնիկների/ածխածնային նանոխողովակների/պոլիվինիլ սպիրտ օրգանոմետաղական շրջանակի կոմպոզիտների վրա՝ ԴՆԹ-ի հիբրիդացման միջոցով ՄԻԱՎ-ի թիրախը հայտնաբերելու համար՝ օգտագործելով մեթիլեն կապույտը որպես ԴՆԹ ռեդոքս ցուցիչ:Վերջերս Chowdury et al.[135] ներկայացրեց հիպոթետիկ հարթակի դիզայն՝ խնամքի կետում μPAD թեստավորման համար՝ օգտագործելով հիվանդի չմշակված թուքը՝ LAMP-ի և շարժական պատկերավորման տեխնոլոգիայի հետ համատեղ՝ COVID-19 անալիտի հայտնաբերման համար:
Կողմնակի հոսքի թեստերն ուղղորդում են հեղուկները մազանոթային ուժերի միջոցով և վերահսկում հեղուկի շարժումը ծակոտկեն կամ միկրոկառուցված ենթաշերտերի թրջելիությամբ և բնութագրերով:Կողային հոսքի սարքերը բաղկացած են նմուշից, կոնյուգատից, ինկուբատորից և հայտնաբերումից և ներծծող բարձիկներից:LFA-ում նուկլեինաթթվի մոլեկուլները ճանաչում են հատուկ կապող նյութեր, որոնք նախապես պահվում են կապման վայրում և կապվում են որպես բարդույթներ:Երբ հեղուկն անցնում է ինկուբացիոն և հայտնաբերման թիթեղների միջով, բարդույթները գրավվում են փորձարկման և հսկողության գծերի վրա տեղակայված գրավման մոլեկուլների կողմից՝ ցույց տալով արդյունքներ, որոնք կարելի է կարդալ անմիջապես անզեն աչքով:Որպես կանոն, LFA-ն կարող է ավարտվել 2-15 րոպեում, ինչը ավելի արագ է, քան ավանդական հայտնաբերումը:Հատուկ մեխանիզմի շնորհիվ LFA-ն պահանջում է քիչ գործողություններ և չի պահանջում լրացուցիչ սարքավորումներ, ինչը այն դարձնում է շատ հարմար օգտագործողի համար:Այն հեշտ է արտադրել և մանրացնել, իսկ թղթի վրա հիմնված ենթաշերտերի արժեքը ավելի ցածր է:Այնուամենայնիվ, այն օգտագործվում է միայն որակական վերլուծության համար, և քանակական հայտնաբերումը շատ դժվար է, և մուլտիպլեքսավորման կարողությունն ու թողունակությունը շատ սահմանափակ են, և միաժամանակ կարող է հայտնաբերվել միայն մեկ բավարար նուկլեինաթթու [96,110,127]:
Չնայած LFA-ի կիրառությունների մեծ մասը կենտրոնացած է իմունային վերլուծությունների վրա, LFA-ի օգտագործումը միկրոհեղուկ չիպերի մոլեկուլային ախտորոշման համար նույնպես արդյունավետ և տարածված է [136]:Հեպատիտ B վիրուսի դեպքում ՄԻԱՎ-ը և SARS-CoV-2 LFA Gong et al.[137] առաջարկեց վերափոխման նանոմասնիկների LFA հարթակ և ցույց տվեց այս մանրացված և շարժական հարթակի բազմակողմանիությունը՝ բազմաթիվ թիրախների զգայուն և քանակական հայտնաբերման միջոցով, ինչպիսին է HBV նուկլեինաթթուն:Բացի այդ, Fu et al.[138] ցուցադրեց նոր LFA, որը հիմնված է մակերեսային բարելավված Raman սպեկտրոսկոպիայի վրա՝ ցածր կոնցենտրացիաներում ՄԻԱՎ-1 ԴՆԹ-ի քանակական վերլուծության համար:SARS-CoV-2-ի արագ և զգայուն հայտնաբերման համար Լյու և այլք.[85] մշակել է միկրոհեղուկով ինտեգրված RPA կողային հոսքի վերլուծություն՝ համատեղելով RT-RPA-ն և կողային հոսքի հայտնաբերման ունիվերսալ համակարգը մեկ միկրոհեղուկ համակարգի մեջ։
Տարբեր միկրոհեղուկ հարթակների կիրառումը տարբերվում է կախված կոնկրետ ուսումնասիրություններից՝ լիովին օգտվելով հարթակների հնարավորություններից և առավելություններից:Մատչելի փականներով, պոմպերով և խողովակներով՝ LOCC-ը կիրառական բազմազանության և փոխգործունակության առավել համապարփակ հարթակն է՝ զարգացման ամենամեծ տարածքով:Ուստի հուսով ենք և խորհուրդ ենք տալիս, որ որպես առաջին փորձ LOCC-ում կատարվեն նորագույն ուսումնասիրություններ և օպտիմալացվեն պայմանները:Բացի այդ, ակնկալվում է ավելի արդյունավետ և ճշգրիտ մեթոդների հայտնաբերում և կիրառում համակարգում:LOAD-ը գերազանցում է գոյություն ունեցող LOCC սարքերի հեղուկների ճշգրիտ կառավարումը և ցույց է տալիս եզակի առավելություններ միայնակ շարժիչներում կենտրոնախույս ուժի միջոցով՝ առանց արտաքին շարժիչների անհրաժեշտության, մինչդեռ զուգահեռ արձագանքները կարող են առանձնացվել և համաժամանակացվել:Այսպիսով, ապագայում LOAD-ը կդառնա հիմնական միկրոհեղուկ հարթակ՝ ավելի քիչ ձեռքով գործառնություններով և ավելի հասուն և ավտոմատացված տեխնոլոգիաներով:«ΜPAD» հարթակը համատեղում է LOCC-ի և թղթի վրա հիմնված նյութերի առավելությունները՝ էժան, մեկանգամյա օգտագործման ախտորոշման համար:Հետևաբար, ապագա զարգացումը պետք է կենտրոնանա հարմար և կայացած տեխնոլոգիաների վրա:Բացի այդ, LFA-ն լավ հարմարեցված է անզեն աչքով հայտնաբերելու համար՝ խոստանալով նվազեցնել նմուշի սպառումը և արագացնել հայտնաբերումը:Պլատֆորմի մանրամասն համեմատությունը ներկայացված է Աղյուսակ 2-ում:
Թվային անալիզները նմուշը բաժանում են բազմաթիվ միկրոռեակտորների, որոնցից յուրաքանչյուրը պարունակում է թիրախային մոլեկուլների որոշակի քանակ [139, 140]:Թվային անալիզները զգալի առավելություններ են տալիս բացարձակ քանակություն կատարելու համար՝ միաժամանակ և առանձին-առանձին կատարելով հազարավոր զուգահեռ կենսաքիմիական փորձեր միկրոն մասշտաբի բաժանմունքներում, այլ ոչ թե շարունակական փուլում:Համեմատած ավանդական միկրոհեղուկների, խցիկային ռեակցիաները կարող են նվազեցնել նմուշի ծավալը, բարձրացնել ռեակցիայի արդյունավետությունը և հեշտությամբ ինտեգրվել այլ վերլուծական մեթոդների հետ՝ առանց ալիքների, պոմպերի, փականների և կոմպակտ դիզայնի անհրաժեշտության [141, 142, 143, 144, 145, 146, 147]։Հետևյալ երկու մեթոդներն օգտագործվում են թվային վերլուծություններում՝ լուծույթների միատեսակ և ճշգրիտ տարանջատման համար, ներառյալ ռեակտիվները և նմուշները, ինչպիսիք են բջիջները, նուկլեինաթթուները և այլ մասնիկներ կամ մոլեկուլներ.(2) զանգվածի բաժանումն իրականացվում է սարքի երկրաչափական սահմանափակումներով։Առաջին մեթոդում միկրոալիքներում ռեակտիվներ և նմուշներ պարունակող կաթիլներ կարող են ստեղծվել պասիվ մեթոդներով, ինչպիսիք են համահոսքը, խաչաձև հոսքը, հոսքի կենտրոնացումը, փուլային էմուլսացումը, միկրոալիքային էմուլսացումը և թաղանթները մածուցիկ կտրվածքի ուժերի և էմուլսացման միջոցով՝ ալիքի փոփոխությամբ:տեղայնացում [143, 145, 146, 148, 149] կամ օգտագործելով ակտիվ մեթոդներ [150, 151], որոնք լրացուցիչ էներգիա են ներմուծում էլեկտրական, մագնիսական, ջերմային և մեխանիկական հսկողության միջոցով:Վերջին մոտեցման դեպքում միկրոհեղուկ խցերում հեղուկի ծավալի լավագույն միատեսակությունը կիսվում է՝ պահպանելով նույն չափի տարածական կառուցվածքները, ինչպիսիք են միկրոփոսերը և մակերեսային զանգվածները [152,153,154]:Հատկանշական է, որ կաթիլները հոսքի հիմնական հատվածներ են, որոնք կարող են ստեղծվել և շահագործվել նաև թվային միկրոհեղուկների (DMF) վրա հիմնված էլեկտրոդների զանգվածների վրա:Դիէլեկտրիկների էլեկտրաթրջումը DMF-ի լավագույն ուսումնասիրված տեսություններից մեկն է, քանի որ դիէլեկտրիկների էլեկտրաթրջումը թույլ է տալիս ճշգրիտ մանիպուլյացիա կատարել առանձին կաթիլներով՝ վերահսկելով հեղուկի ձևը և տարբեր կողմերից անցնող ասիմետրիկ էլեկտրական ազդանշանները [141, 144]:DMF-ում կաթիլների հետ կապված հիմնական գործողությունները ներառում են տեսակավորումը, բաժանումը և միաձուլումը [151, 155, 156], որոնք կարող են կիրառվել վերլուծության տարբեր ոլորտներում, հատկապես մոլեկուլային հայտնաբերման մեջ [157, 158, 159]:
Թվային նուկլեինաթթվի հայտնաբերումը երրորդ սերնդի մոլեկուլային ախտորոշման տեխնոլոգիա է, որը հետևում է սովորական PCR-ին և քանակական իրական ժամանակի PCR-ին (qPCR), զուգահեռ բարձր թողունակության հաջորդականության և հեղուկ բիոպսիային:Վերջին երկու տասնամյակների ընթացքում թվային նուկլեինաթթուները արագորեն զարգանում են վարակիչ պաթոգենների մոլեկուլային ախտորոշման ոլորտում [160, 161, 162]:Թվային նուկլեինաթթվի հայտնաբերման բացարձակ քանակականացումը սկսվում է նմուշների և ռեակտիվների փաթեթավորումից առանձին խցիկներում՝ ապահովելու համար, որ յուրաքանչյուր թիրախային հաջորդականություն ունենա յուրաքանչյուր առանձին խցիկ մտնելու նույն հավանականությունը:Տեսականորեն, յուրաքանչյուր հատվածին կարող է վերագրվել մի քանի թիրախային հաջորդականություն, կամ կարող է չլինել միկրոռեակցիայի անկախ համակարգ:Վերևում նկարագրված տարբեր զգայական մեխանիզմների միջոցով մանրէաբանական թիրախային հաջորդականություններով բաժանմունքները, որոնք ազդանշաններ են առաջացնում որոշակի շեմից բարձր, կարող են անզեն աչքով կամ մեքենայի միջոցով պատկերվել և պիտակավորվել որպես դրական, մինչդեռ շեմից ցածր ազդանշաններ ստեղծող այլ բաժանմունքները պիտակավորված են որպես դրական: .բացասականները, որոնք յուրաքանչյուր հատվածի ազդանշանը դարձնում են բուլյան:Այսպիսով, հաշվարկելով ստեղծված բաժանմունքների քանակը և ռեակցիայից հետո դրական արդյունքների արագությունը, փորձարկման նմուշների բնօրինակները կարող են համընկնել Պուասոնի բաշխման բանաձևի միջոցով՝ առանց ստանդարտ կորի անհրաժեշտության, որն անհրաժեշտ է սովորական քանակական վերլուծությունների համար, ինչպիսիք են. որպես qPCR:[163] Համեմատած ավանդական մոլեկուլային ախտորոշման մեթոդների հետ՝ թվային նուկլեինաթթվի հայտնաբերումն ունի ավտոմատացման ավելի բարձր աստիճան, վերլուծության ավելի բարձր արագություն և զգայունություն, ավելի քիչ ռեագենտներ, ավելի քիչ աղտոտվածություն և ավելի պարզ ձևավորում և արտադրություն։Այս պատճառներով թվային վերլուծությունների, հատկապես կաթիլային մեթոդների կիրառումը մոլեկուլային ախտորոշման համար, որը համատեղում է ուժեղացման և ազդանշանի ընթերցման տեխնիկան, լավ ուսումնասիրվել է SARS-CoV-2-ի կրիտիկական բռնկման ժամանակ:Օրինակ, Yin et al.[164] միավորեց կաթիլային թվային և արագ PCR մեթոդները՝ միկրոհեղուկ չիպի մեջ SARS-CoV-2-ում ORF1ab, N և RNase P գեները հայտնաբերելու համար:Հատկանշական է, որ համակարգը կարողացավ բացահայտել դրական ազդանշանը 115 վայրկյանի ընթացքում, որն ավելի արագ է, քան սովորական PCR-ը, ինչը ցույց է տալիս դրա արդյունավետությունը խնամքի կետի հայտնաբերման գործում (Նկար 7ա):Դոնգը և այլք։[165], Sow et al.[157], Chen et al.[166] եւ Alteri et al.[167] նաև կիրառել է կաթիլային թվային PCR (ddPCR)՝ SARS-CoV-2-ը միկրոհեղուկ համակարգում հայտնաբերելու համար՝ տպավորիչ արդյունքներով:Հայտնաբերման արագությունը հետագայում բարելավելու համար Շենը և այլք.[168] ստացվեց ddPCR-ի վրա հիմնված չիպերի պատկերացում 15 վայրկյանում առանց պատկերի կարման տեխնիկայի օգտագործման՝ արագացնելով ddPCR տեխնոլոգիայի գործընթացը լաբորատորիայից մինչև կիրառություն:Կիրառվում են ոչ միայն ջերմային ուժեղացման մեթոդներ, ինչպիսին է PCR-ն, այլ նաև օգտագործվում են իզոթերմային ուժեղացման մեթոդներ՝ ռեակցիայի պայմանները և արագ արձագանքը պարզեցնելու համար:Լու et al.[71] մշակել է SlipChip-ը կաթիլների վերլուծության համար, որն ունակ է մեկ քայլով առաջացնել տարբեր չափերի կաթիլներ բարձր խտությամբ և քանակականացնել SARS-CoV-2 նուկլեինաթթուները՝ օգտագործելով թվային LAMP (Նկար 7b):Որպես արագ զարգացող տեխնոլոգիա՝ CRISPR-ը կարող է նաև կարևոր դեր խաղալ թվային նուկլեինաթթվի հայտնաբերման գործում՝ հարմար գունաչափական պատկերման միջոցով՝ առանց լրացուցիչ նուկլեինաթթվային բծերի անհրաժեշտության:Աքերմանը և այլք:մշակել է կոմբինատոր մատրիցային ռեակցիա՝ նուկլեինաթթուների մուլտիպլեքսային գնահատման համար:[158] միկրոհորի վերլուծության ժամանակ հայտնաբերել է մարդու հետ կապված 169 վիրուս, ներառյալ SARS-CoV-2-ը, CRISPR-Cas13-ի վրա հիմնված նուկլեինաթթվի հայտնաբերման ռեակտիվներ պարունակող կաթիլներում (Նկար 7c):Բացի այդ, իզոթերմային ուժեղացումը և CRISPR տեխնոլոգիան կարող են օգտագործվել նույն համակարգում՝ համատեղելու երկուսի առավելությունները:Park et al.[169] CRISPR/Cas12a թվային փորձարկումը մշակվել է առևտրային միկրոհեղուկ չիպի մեջ՝ արդյունահանվող և ջերմությամբ սպանված SARS-CoV-2-ի հայտնաբերման համար՝ հիմնված միաստիճան RT-RPA-ի վրա՝ ազդանշանից ֆոն հայտնաբերման ավելի կարճ և բարձր մակարդակով: ժամանակի հարաբերակցությունը., ավելի լայն դինամիկ տիրույթ և ավելի լավ զգայունություն (նկ. 7d):Այս օրինակների որոշ նկարագրություններ տրված են Աղյուսակ 3-ում:
Նուկլեինաթթվի հայտնաբերման բնորոշ թվային հարթակ:ա Արագ թվային PCR աշխատանքային հոսքը բաղկացած է չորս հիմնական քայլերից՝ նմուշի պատրաստում, ռեակցիայի խառնուրդի բաշխում, ուժեղացման գործընթաց և թիրախային քանակականացում (հարմարեցված է [164]-ից):բ Սխեմատիկ ցուցադրում է SlipChip կաթիլների վերլուծությունը բարձր խտության դեպքում կաթիլների առաջացման համար (հարմարեցված է [71]-ից):c CARMEN-Cas աշխատանքային հոսքի դիագրամ13 (հարմարեցված է [158]-ից):դ CRISPR/Cas-ով վիրուսների առաջադեմ թվային հայտնաբերման ակնարկ՝ մեկ կաթսայում (հարմարեցված է [169]-ից):W/O ջուր յուղի մեջ, պոլիդիմեթիլսիլոքսան PDMS, PCR պոլիմերազային շղթայական ռեակցիա, DAQ տվյալների հավաքագրում, PID համամասնական ինտեգրալ ածանցյալ, CARMEN կոմբինատոր մատրիցային ռեակցիա մուլտիպլեքս նուկլեինաթթվի գնահատման համար, SARS-CoV-2, սուր սուր շնչառական համախտանիշ, կորոնավիրուս 2, RT Հակադարձ տրանսկրիպտազի ռեկոմբինազ պոլիմերազ-RPA ուժեղացում, S/B ազդանշան ֆոնին