Նորություններ

Շնորհակալություն Nature.com այցելելու համար:Ձեր օգտագործած բրաուզերի տարբերակը ունի սահմանափակ CSS աջակցություն:Լավագույն փորձի համար խորհուրդ ենք տալիս օգտագործել թարմացված դիտարկիչ (կամ անջատել Համատեղելիության ռեժիմը Internet Explorer-ում):Միևնույն ժամանակ, շարունակական աջակցությունն ապահովելու համար մենք կայքը կներկայացնենք առանց ոճերի և JavaScript-ի:
Ակտիվացված էսթերների կամ ֆենոքսի ռադիկալների վրա հիմնված ֆերմենտային հարևանության պիտակավորման մեթոդները լայնորեն օգտագործվում են կենդանի բջիջներում ենթաբջջային պրոտեոմների և սպիտակուցային փոխազդեցությունների քարտեզագրման համար:Այնուամենայնիվ, ակտիվացված էսթերները ավելի քիչ ռեակտիվ են, ինչը հանգեցնում է պիտակավորման լայն շառավղին, և պերօքսիդի մշակման արդյունքում առաջացած ֆենոքսի ռադիկալները կարող են խանգարել ռեդոքսային ուղիներին:Այստեղ մենք զեկուցում ենք հարևանության պիտակավորման կախված ֆոտոակտիվացման (PDPL) մեթոդի մասին, որը մշակվել է՝ գենետիկորեն կապելով miniSOG ֆոտոզգայուն պրոտեինը հետաքրքրող սպիտակուցին:Կապույտ լույսի ազդեցությամբ և ազդեցության ժամանակի միջոցով վերահսկվող թթվածին է առաջանում, այնուհետև ձեռք է բերվում հիստիդինի մնացորդների տարածականորեն լուծված պիտակավորում անիլինային զոնդի միջոցով:Մենք ցույց ենք տալիս դրա բարձր հավատարմությունը օրգանելներին հատուկ պրոտեոմի քարտեզագրման միջոցով:PDPL-ի կողք կողքի համեմատությունը TurboID-ի հետ ցույց է տալիս PDPL-ի ավելի կոնկրետ և համապարփակ պրոտեոմային ծածկույթ:Այնուհետև մենք PDPL կիրառեցինք հիվանդության հետ կապված տրանսկրիպցիոն կոակտիվատորի BRD4 և E3 Պարկինի լիգազի վրա և գտանք նախկինում անհայտ փոխազդեցություններ:Գերարտահայտման սքրինինգի միջոցով հայտնաբերվեցին երկու անհայտ սուբստրատներ՝ Ssu72 և SNW1 Պարկինի համար, որոնց քայքայումը միջնորդվում է ուբիկվիտինացիա-պրոտեզոմային ճանապարհով:
Սպիտակուցային ցանցերի ճշգրիտ բնութագրումը շատ հիմնարար բջջային գործընթացների հիմքում է:Հետևաբար, սպիտակուցների փոխազդեցությունների բարձր ճշգրիտ տարածական-ժամանակային քարտեզագրումը մոլեկուլային հիմք կստեղծի կենսաբանական ուղիների, հիվանդության պաթոլոգիայի վերծանման և այդ փոխազդեցությունները բուժական նպատակներով խաթարելու համար:Այդ նպատակով կենդանի բջիջներում կամ հյուսվածքներում ժամանակավոր փոխազդեցությունները հայտնաբերելու ունակ մեթոդները խիստ ցանկալի են:Affinity Purification Mass spectrometry (AP-MS) պատմականորեն օգտագործվել է հետաքրքրող սպիտակուցների (POIs) կապող գործընկերներին հայտնաբերելու համար:Քանակական պրոտեոմիկայի մեթոդների մշակմամբ ստեղծվել է Bioplex3.0՝ AP-MS-ի վրա հիմնված սպիտակուցային ցանցերի ամենամեծ տվյալների բազան։Թեև AP-MS-ը շատ հզոր է, աշխատանքային հոսքում բջիջների լիզման և նոսրացման քայլերը կողմնակալ են դեպի թույլ և անցողիկ կապող փոխազդեցությունները և ներմուծում են հետլիզային արտեֆակտներ, ինչպիսիք են կեղծ փոխազդեցության զույգերը, որոնք չունեն մասնատում մինչև լիզը:
Այս խնդիրները լուծելու համար մշակվել են անբնական ամինաթթուներ (UAA)՝ խաչաձև կապող խմբերով և մոտակա պիտակավորման ֆերմենտային (PL) հարթակներով (օրինակ՝ APEX և BioID)5:Թեև UAA մեթոդը հաջողությամբ կիրառվել է բազմաթիվ սցենարներում և տրամադրում է տեղեկատվություն ուղղակի սպիտակուցային սոսինձների մասին, UAA-ի տեղադրման վայրի օպտիմալացումը դեռևս պահանջվում է:Ավելի կարևոր է, որ դա ստոյխիոմետրիկ պիտակավորման մեթոդ է, որը չունի պիտակավորման իրադարձությունների կատալիտիկ հակադարձում:Ի հակադրություն, PL ֆերմենտային մեթոդները, ինչպիսին է BioID մեթոդը, միաձուլում են մշակված բիոտինի լիգազան POI7-ին, որը հետագայում ակտիվացնում է բիոտինը՝ ձևավորելով ռեակտիվ բիոտինիլ-AMP էսթեր միջանկյալ նյութ:Այսպիսով, ֆերմենտը կատալիզացնում և ազատում է ակտիվացված բիոտինի «ամպը», որը նշում է լիզինի մոտակա մնացորդները:Այնուամենայնիվ, BioID-ին պահանջվում է ավելի քան 12 ժամ՝ բավարար պիտակավորված ազդանշան ստանալու համար, ինչը բացառում է դրա օգտագործումը ժամանակավոր լուծմամբ:Օգտագործելով խմորիչ ցուցադրման վրա հիմնված ուղղորդված էվոլյուցիան՝ TurboID-ը նախագծվել է BioID-ի հիման վրա, որպեսզի ավելի արդյունավետ լինի՝ թույլ տալով արդյունավետ պիտակավորում բիոտինով 10 րոպեի ընթացքում՝ թույլ տալով ավելի դինամիկ գործընթացների ուսումնասիրություն:Քանի որ TurboID-ը շատ ակտիվ է, և էնդոգեն բիոտինի մակարդակները բավարար են ցածր մակարդակի պիտակավորման համար, ֆոնային պիտակավորումը դառնում է պոտենցիալ խնդիր, երբ էկզոգեն բիոտինի ավելացումով պահանջվում է խիստ ուժեղացված և ժամանակին պիտակավորում:Բացի այդ, ակտիվացված էսթերները թույլ ռեակտիվ են (t1/2 ~ 5 րոպե), ինչը կարող է հանգեցնել պիտակավորման մեծ շառավիղի, հատկապես հարևան սպիտակուցների հագեցվածությունից հետո բիոտին 5-ով: Մեկ այլ մոտեցմամբ, ինժեներական ասկորբատ պերօքսիդազի գենետիկ միաձուլումը (այսինքն՝ բիոտին- ֆենոլային ռադիկալներ և թույլ է տալիս սպիտակուցի պիտակավորումը մեկ րոպեի ընթացքում9,10: APEX-ը լայնորեն օգտագործվում է ենթաբջջային պրոտեոմները, թաղանթային սպիտակուցային համալիրները և ցիտոզոլային ազդանշանային սպիտակուցային համալիրները հայտնաբերելու համար11,12: Այնուամենայնիվ, պերօքսիդների բարձր կոնցենտրացիաների անհրաժեշտությունը կարող է ազդել ռեդոքս սպիտակուցների կամ ուղիների վրա՝ խաթարելով բջջային գործընթացներ.
Այսպիսով, նոր մեթոդը, որը կարող է առաջացնել ավելի ռեակտիվ պիտակավորված շառավղով ճնշող տեսակներ՝ բարձր տարածական և ժամանակային ճշգրտությամբ՝ առանց բջջային ուղիների էապես խաթարելու, գոյություն ունեցող մեթոդների կարևոր հավելում կլինի: Ռեակտիվ տեսակների մեջ մեր ուշադրությունը գրավել է միայնակ թթվածինը իր կարճ կյանքի և սահմանափակ դիֆուզիոն շառավղով (t1/2 < 0,6 µs բջիջներում)13: Ռեակտիվ տեսակների մեջ մեր ուշադրությունը գրավել է միայնակ թթվածինը իր կարճ կյանքի և սահմանափակ դիֆուզիոն շառավղով (t1/2 < 0,6 µs բջիջներում)13: Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках)13. Ակտիվ ձևերի շարքում մեր ուշադրությունը գրավեց միայնակ թթվածինը իր կարճ կյանքի և սահմանափակ դիֆուզիոն շառավիղով (t1/2 <0,6 µs բջիջներում)13:在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细径有限（细径有限（细径有限（细径有限（细胞中泑t1. 1/2 < 0,6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках). Ակտիվ ձևերից մեր ուշադրությունը գրավում է միայնակ թթվածինը իր կարճ կյանքի և սահմանափակ դիֆուզիոն շառավղով (t1/2 <0.6 μs բջիջներում):Հաղորդվում է, որ միանվագ թթվածինը պատահականորեն օքսիդացնում է մեթիոնինը, թիրոզինը, հիստիդինը և տրիպտոֆանը, դարձնելով այն բևեռային 14,15՝ ամինի կամ թիոլի վրա հիմնված զոնդերին կցելու համար16,17:Թեև եզակի թթվածինը օգտագործվել է ենթաբջջային հատվածի ՌՆԹ-ն պիտակավորելու համար, էնդոգեն POI հարևանության մարկերների վերօգտագործման ռազմավարությունները մնում են չուսումնասիրված:Այստեղ մենք ներկայացնում ենք մի հարթակ, որը կոչվում է ֆոտոակտիվացումից կախված հարևանության պիտակավորում (PDPL), որտեղ մենք օգտագործում ենք կապույտ լույս՝ լուսավորելու POI-ները՝ միաձուլված miniSOG ֆոտոզգայունացուցիչի հետ և հրահրում է թթվածնի արտադրությունը՝ մոտակա մնացորդները օքսիդացնելու համար, որին հաջորդում են ամին պարունակող փոփոխություններ՝ քիմիական զոնդերը օքսիդացնելու համար: միջանկյալ կենդանի բջիջներ..Մենք փորձարկեցինք քիմիական զոնդերի խումբ՝ պիտակների առանձնահատկությունը առավելագույնի հասցնելու համար և հայտնաբերեցինք փոփոխման վայրեր՝ օգտագործելով բաց պրոտեոմիկայի աշխատանքային հոսքը:PDPL-ի կողք կողքի համեմատությունը TurboID-ի հետ ցույց է տալիս PDPL-ի ավելի կոնկրետ և համապարփակ պրոտեոմային ծածկույթ:Մենք կիրառեցինք այս մոտեցումը ենթաբջջային պրոտեոմի օրգանելային հատուկ մարկերների և քաղցկեղի հետ կապված էպիգենետիկ կարգավորող BRD4 սպիտակուցի և Պարկինսոնի հիվանդության հետ կապված E3 լիգազի Պարկինի համար կապող գործընկերների ընդհանուր պրոտեոմի նույնականացման համար, ինչը հաստատեց սպիտակուցների և՛ հայտնի, և՛ անհայտ ցանցը: փոխազդեցություններ..Խոշոր սպիտակուցային համալիրներում E3 սուբստրատները ճանաչելու PDPL-ի կարողությունը ներկայացնում է մի իրավիճակ, որտեղ պահանջվում է անուղղակի կապող նյութերի ճանաչում:Երկու անհայտ պարկինային սուբստրատներ՝ միջնորդավորված ubiquitination-proteasome-ով, հաստատվել են տեղում:
Ֆոտոդինամիկական թերապիան (PDT)19 և քրոմոֆորի օգնությամբ լազերային ապաակտիվացումը (CALI)20, որի դեպքում լուսազգայուն սարքերով լույսի ճառագայթումը առաջացնում է միանգամյա թթվածին, կարող է ապաակտիվացնել թիրախային սպիտակուցները կամ առաջացնել բջիջների մահ:Քանի որ միաձույլ թթվածինը խիստ ռեակտիվ նյութ է, որի տեսական դիֆուզիոն հեռավորությունը կազմում է մոտ 70 նմ, ֆոտոզգայունացնողի շուրջ տարածականորեն սահմանափակ օքսիդացումը կարող է վերահսկվել:Ելնելով այս հայեցակարգից՝ մենք որոշեցինք օգտագործել միայնակ թթվածին՝ կենդանի բջիջներում սպիտակուցային բարդույթների սերտ պիտակավորման հասնելու համար:Մենք մշակել ենք PDPL քիմիպրոտեոմիկ մոտեցում՝ կատարելու չորս գործառույթ.(2) տրամադրել ժամանակի լուծվող պիտակավորում լույսի մեկնարկի ժամանակ.(3) փոփոխությամբ (4) Խուսափեք օգտագործել էնդոգեն կոֆակտորներ (օրինակ՝ բիոտինը)՝ ֆոնը նվազեցնելու համար, կամ օգտագործել խիստ անհանգստացնող էկզոգեն ռեակտիվներ (օրինակ՝ պերօքսիդներ)՝ նվազագույնի հասցնելու բջիջների ազդեցությունը շրջակա միջավայրի սթրեսին:
Ֆոտոսենսիտիզատորները կարելի է բաժանել երկու կատեգորիայի՝ ներառյալ փոքր մոլեկուլային քաշի ֆտորոֆորները (օրինակ՝ վարդ բենգալ, մեթիլեն կապույտ)22 և գենետիկորեն կոդավորված փոքր սպիտակուցներ (օրինակ՝ miniSOG, KillerRed)23:Մոդուլային դիզայնի հասնելու համար մենք մշակեցինք առաջին սերնդի PDPL հարթակը` ավելացնելով ֆոտոզգայունացնող (PS) սպիտակուցներ POI24,25-ին (Նկար 1ա):Կապույտ լույսով ճառագայթվելիս միաձույլ թթվածինը օքսիդացնում է մոտակա նուկլեոֆիլ ամինաթթուների մնացորդները, ինչի արդյունքում առաջանում է միանգամյա բևեռականություն, որը էլեկտրոֆիլ է և կարող է հետագայում արձագանքել ամինային զոնդի նուկլեոֆիլների հետ16,17:Զոնդը նախագծված է ալկինային բռնակով, որը թույլ է տալիս սեղմել քիմիան և ներքև քաշել LC/MS/MS բնութագրման համար:
miniSOG-ի միջնորդությամբ սպիտակուցային համալիրների պիտակավորման սխեմատիկ նկարազարդում:Երբ ենթարկվում են կապույտ լույսի, miniSOG-POI արտահայտող բջիջները արտադրում են միանգամյա թթվածին, որը փոփոխում է փոխազդող սպիտակուցները, բայց ոչ կապող սպիտակուցները:Ֆոտոքսիդավորման միջանկյալ արտադրանքները խափանում են ամինային քիմիական զոնդի ռելեային պիտակներով՝ ձևավորելով կովալենտային հավելումներ:Ալկինիլային խումբը քիմիական զոնդի վրա թույլ է տալիս սեղմել քիմիան հարստացնելով դեպի ներքեւ, որին հաջորդում է LC-MS/MS քանակականացումը:բ Ամինային զոնդերի քիմիական կառուցվածքը 1-4.գ Միտոքոնդրիումային տեղայնացված miniSOG-ով միջնորդավորված պրոտեոմիկ մարկերների ներկայացուցչական լյումինեսցենտային գելային վերլուծություն՝ օգտագործելով զոնդերը 1-4 և հարաբերական քանակությունը՝ հիմնված գելային խտության վրա:Քիմիական զոնդերի ազդանշան-ֆոն հարաբերակցությունը գնահատվել է բացասական հսկողության փորձերի միջոցով՝ բացառելով կապույտ լույսը կամ օգտագործելով HEK293T բջիջներ՝ առանց miniSOG արտահայտման:n = 2 կենսաբանորեն անկախ նմուշներ:Յուրաքանչյուր կետ ներկայացնում է կենսաբանական կրկնօրինակ:դ PDPL-ի ներկայացուցչական հայտնաբերում և քանակականացում՝ օգտագործելով օպտիմիզացված զոնդ 3՝ նշված PDPL բաղադրիչների առկայության կամ բացակայության դեպքում, ինչպիսիք են c.n = 3 կենսաբանորեն անկախ նմուշներ:Յուրաքանչյուր կետ ներկայացնում է կենսաբանական կրկնօրինակ:Կենտրոնական գծերը և բեղերը ներկայացնում են միջին և ± ստանդարտ շեղումը:CBB: Coomassie Brilliant Blue:ե Միանգամյա թթվածնի կոնֆոկալ պատկերացում՝ հեռավոր կարմիր Si-DMA բիծով:Սանդղակի սանդղակ՝ 10 մկմ:Գելային պատկերման և կոնֆոկալ փորձերը ինքնուրույն կրկնվել են առնվազն երկու անգամ՝ նմանատիպ արդյունքներով:
Մենք նախ փորձարկեցինք հասուն ֆոտոզգայունացուցիչ miniSOG26 և KillerRed23, կայուն արտահայտված HEK293T-ում, միջնորդելու պրոպարգիլամինային պիտակավորումը պրոտեոմի որպես քիմիական զոնդ (Լրացուցիչ նկար 1ա):Գելի ֆլուորեսցենտային վերլուծությունը ցույց է տվել, որ ամբողջ պրոտեոմի պիտակավորումը ձեռք է բերվել miniSOG-ի և կապույտ լույսի ճառագայթման միջոցով, մինչդեռ KillerRed-ով տեսանելի պիտակավորման արտադրանք չի նկատվել:Ազդանշան-ֆոն հարաբերակցությունը բարելավելու համար մենք այնուհետև փորձարկեցինք անիլին (1 և 3), պրոպիլամին (2) կամ բենզիլամին (4) պարունակող քիմիական զոնդերի մի շարք:Մենք նկատեցինք, որ HEK293T բջիջներն իրենք ունեին ավելի բարձր ֆոնային ազդանշան՝ համեմատած կապույտ լույսի բացակայության հետ, հնարավոր է, որ պայմանավորված է էնդոգեն ռիբոֆլավինի ֆոտոզգայունացնող ֆլավինի մոնոնուկլեոտիդով (FMN) 27: Անիլինի վրա հիմնված քիմիական զոնդերը 1 և 3 տվել են ավելի լավ սպեցիֆիկություն, ընդ որում HEK293T-ը կայուն արտահայտում է miniSOG-ը միտոքոնդրիայում և ցուցադրում է ազդանշանի >8 անգամ ավելացում 3-ի համար, մինչդեռ 2-րդ զոնդը, որն օգտագործվում է ՌՆԹ պիտակավորման մեթոդով, CAP-seq ցուցադրում է միայն ~2,5-: ազդանշանի ծալովի ավելացում, հավանաբար ՌՆԹ-ի և սպիտակուցի միջև ռեակտիվության տարբեր նախապատվությունների պատճառով (նկ. 1b, c): Անիլինի վրա հիմնված քիմիական զոնդերը 1 և 3 տվել են ավելի լավ սպեցիֆիկություն, ընդ որում HEK293T-ը կայուն արտահայտում է miniSOG-ը միտոքոնդրիայում և ցուցադրում է ազդանշանի >8 անգամ ավելացում 3-ի համար, մինչդեռ 2-րդ զոնդը, որն օգտագործվում է ՌՆԹ պիտակավորման մեթոդով, CAP-seq ցուցադրում է միայն ~2,5-: ազդանշանի ծալովի ավելացում, հավանաբար ՌՆԹ-ի և սպիտակուցի միջև ռեակտիվության տարբեր նախապատվությունների պատճառով (նկ. 1b, c):Անիլինի վրա հիմնված քիմիական զոնդերը 1 և 3 ցույց են տվել ավելի լավ սպեցիֆիկություն. HEK293T, որը կայունորեն արտահայտում է miniSOG-ը միտոքոնդրիայում, ցույց է տալիս 3-ի ազդանշանի ավելի քան 8 անգամ ավելացում, մինչդեռ զոնդ 2-ը, որն օգտագործվում է միայն CAP-seq RNA պիտակավորման մեթոդում: ցույց է տալիս ազդանշանի ~2,5 անգամ ավելացում, հավանաբար ՌՆԹ-ի և սպիտակուցի միջև ռեակտիվության տարբեր նախապատվությունների պատճառով (նկ. 1b, c):基于 的 化学化学 1 和 和 和 具有 具有 具有 具有 具有 具有 的 特异性, Hek293t 在 线 粒体 中 稳定 表达 Minisog, 探针 3 的 信号 增加> 8 倍, 而 用 于 RNA 标记 方法 cap-seq 的 探针 显示 ~ 2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）。基于 的 化学 和 1 和 具有 具有 具有 的 的 具有 具有 具有 具有 粒体 粒体 粒体 粒体 表达 表达 粒体 稳定 稳定 稳定 表达 探针 探针 的 表达 表达 表达 稳定 稳定 稳定 表达 探针 的 信号 信号> RNA 标记 CAP-EQ 的 2 ~ ~ ~ 2.5 -倍信号增加，可能是由于RNAԱնիլինի վրա հիմնված քիմիական զոնդերը 1 և 3 ավելի լավ սպեցիֆիկություն ունեին, HEK293T-ը կայունորեն արտահայտեց miniSOG միտոքոնդրիում, իսկ զոնդ 3-ն ուներ ավելի քան 8 անգամ ազդանշանի աճ, մինչդեռ CAP-seq ՌՆԹ պիտակավորման մեթոդի համար զոնդը ցույց տվեց ընդամենը ~ 2,5 անգամ աճ:ազդանշանում, հավանաբար ՌՆԹ-ի և սպիտակուցի միջև տարբեր ռեակցիաների նախապատվությունների պատճառով (նկ. 1b, c):Բացի այդ, փորձարկվել են զոնդ 3-ի իզոմերները և հիդրազինային զոնդերը (զոնդեր 5, 6, 7), որոնք հաստատել են զոնդ 3-ի օպտիմալացումը (Լրացուցիչ նկար 1b,c):Նմանապես, գելային ֆլուորեսցենտային վերլուծությունը բացահայտեց այլ օպտիմիզացված փորձարարական պարամետրեր՝ ճառագայթման ալիքի երկարությունը (460 նմ), քիմիական զոնդի կոնցենտրացիան (1 մՄ) և ճառագայթման ժամանակը (20 րոպե) (Լրացուցիչ նկար 2ա–գ):PDPL արձանագրության մեջ որևէ բաղադրիչ կամ քայլ բաց թողնելը հանգեցրեց ազդանշանի զգալի հետադարձմանը (նկ. 1դ):Հատկանշական է, որ սպիտակուցների պիտակավորումը զգալիորեն կրճատվել է նատրիումի ազիդի կամ տրոլոքսի առկայության դեպքում, որոնք, ինչպես հայտնի է, հանգցնում են միայնակ թթվածինը:D2O-ի առկայությունը, որը, ինչպես հայտնի է, կայունացնում է թթվածինը, ուժեղացնում է պիտակավորման ազդանշանը:Թթվածնի այլ ռեակտիվ տեսակների ներդրումը պիտակավորման մեջ ուսումնասիրելու համար ավելացվել են մանիտոլ և վիտամին C՝ համապատասխանաբար հիդրոքսիլ և սուպերօքսիդ ռադիկալների մաքրող միջոցներ ստեղծելու համար, 18, 29, սակայն դրանք չեն հայտնաբերվել, որ նվազեցնում են պիտակավորումը:H2O2-ի ավելացումը, բայց ոչ լուսավորությունը, չի հանգեցրել պիտակավորման (Լրացուցիչ Նկ. 3ա):Si-DMA զոնդերով լյումինեսցենտային թթվածնի պատկերումը հաստատեց թթվածնի առկայությունը HEK293T-miniSOG լարում, բայց ոչ սկզբնական HEK293T մետաղալարում:Բացի այդ, mitoSOX Red-ը չկարողացավ հայտնաբերել սուպերօքսիդի արտադրությունը լուսավորվելուց հետո (նկ. 1e և լրացուցիչ նկ. 3b) 30: Այս տվյալները վճռականորեն ցույց են տալիս, որ թթվածնի հիմնական ռեակտիվ տեսակն է, որը պատասխանատու է հետագա պրոտեոմային պիտակավորման համար:Գնահատվել է PDPL-ի ցիտոտոքսիկությունը, ներառյալ կապույտ լույսի ճառագայթումը և քիմիական զոնդերը, և նշանակալի ցիտոտոքսիկություն չի նկատվել (Լրացուցիչ նկար 4ա):
Պիտակավորման մեխանիզմը ուսումնասիրելու և LC-MS/MS-ի միջոցով սպիտակուցային բարդույթների պրոտեոմիկ նույնականացումը հնարավոր դարձնելու համար մենք նախ պետք է որոշենք, թե որ ամինաթթուներն են փոփոխված և զոնդերի դելտա զանգվածը:Հաղորդվում է, որ մեթիոնինը, հիստիդինը, տրիպտոֆանը և թիրոզինը փոփոխվել են մեկ թթվածնի միջոցով14,15:Մենք ինտեգրում ենք TOP-ABPP31 աշխատանքային հոսքը MSFragger32-ի վրա հիմնված FragPipe հաշվողական հարթակի կողմից տրամադրված անաչառ բաց որոնման հետ:Միանգամյա թթվածնի մոդիֆիկացիայից և քիմիական զոնդի պիտակավորումից հետո, սեղմված քիմիան իրականացվել է բիոտինի նվազեցման պիտակի միջոցով, որը պարունակում է ճեղքվող կապիչ, որին հաջորդում է նեյտրավիդինի ձգումը և տրիփսինի մարսումը:Ձևափոխված պեպտիդը, որը դեռևս կապված է խեժին, լուսաբեկվել է LC-MS/MS վերլուծության համար (Նկար 2ա և Լրացուցիչ տվյալներ 1):Մեծ թվով փոփոխություններ են տեղի ունեցել պրոտեոմի ողջ տարածքում՝ թվարկված ավելի քան 50 պեպտիդային քարտեզի (PSM) համընկնումներով (նկ. 2b):Զարմանալիորեն, մենք նկատեցինք միայն հիստիդինի փոփոխությունը, հավանաբար, պայմանավորված է օքսիդացված հիստիդինի ավելի բարձր ռեակտիվությամբ անիլինային զոնդերի նկատմամբ, քան մյուս ամինաթթուները:Համաձայն միանգամյա թթվածնի միջոցով հիստիդինի օքսիդացման հրապարակված մեխանիզմի,21,33 +229 Da-ի առաջարկվող դելտա-զանգվածային կառուցվածքը համապատասխանում է զոնդի 3-ի 2-օքսո-հիստիդինի հետ երկու օքսիդացումներից հետո, մինչդեռ +247 Da-ն հիդրոլիզի արդյունքն է։ +229 Da-ի (Լրացուցիչ Նկ. 5):MS2 սպեկտրի գնահատումը ցույց տվեց y և b իոնների մեծ մասի նույնականացման բարձր հուսալիություն, ներառյալ փոփոխված հատվածի իոնների (y և b) նույնականացումը (նկ. 2c):PDPL-ով ձևափոխված հիստիդինների տեղական հաջորդականության համատեքստային վերլուծությունը բացահայտեց չափավոր մոտիվային նախապատվություն փոքր հիդրոֆոբ մնացորդների համար ±1 դիրքերում (Լրացուցիչ նկար 4b):Միջին հաշվով, յուրաքանչյուր սպիտակուցի համար հայտնաբերվել է 1.4 հիստիդին, և այդ մարկերների տեղամասերը որոշվել են լուծիչով հասանելի մակերեսի (SASA) և լուծիչների հարաբերական հասանելիության (RSA) վերլուծության միջոցով (Լրացուցիչ նկար 4c,d):
Անկողմնակալ աշխատանքային հոսք՝ մնացորդային ընտրողականությունն ուսումնասիրելու համար՝ օգտագործելով FragPipe հաշվողական հարթակը, որը սնուցվում է MSFragger-ի կողմից:Կտրվող կապակցիչներ օգտագործվում են Click քիմիայում՝ թույլ տալու համար ստրեպտավիդինային խեժից փոփոխված պեպտիդների ֆոտոկտրումը:Բաց որոնում է սկսվել բազմաթիվ փոփոխություններ, ինչպես նաև համապատասխան մնացորդներ հայտնաբերելու համար։բ Նշեք փոփոխությունների զանգվածը, որոնք տեղի են ունենում պրոտեոմում:Պեպտիդային քարտեզագրում PSM.c MS2 սպեկտրալ անոտացիա հիստիդինային տեղամասերի՝ ձևափոխված զոնդով 3: Որպես ներկայացուցչական օրինակ, կովալենտային ռեակցիան 3 զոնդով ավելացրել է +229,0938 Da փոփոխված ամինաթթուն:դ Մուտացիաների վերլուծություն, որն օգտագործվում է PDPL մարկերների համար:PRDX3 (H155A, H225A) և PRDX1 (H10A, H81A, H169A) փոխարկվել են վայրի տիպի պլազմիդներով՝ հակադրոշակի հայտնաբերման համար:ե Սինթետիկ պեպտիդը արձագանքել է զտված miniSOG-ի հետ՝ զոնդ 3-ի առկայության դեպքում, և Δm +247 և +229 համապատասխան արտադրանքները նշվել են LC-MS սպեկտրում:f in vitro սպիտակուց-սպիտակուց փոխազդեցությունները մոդելավորված miniSOG-6xHis-tag-ով և anti-6xHis հակամարմիններով:Հակաբիոտինի (streptavidin-HRP) և miniSOG-6xHis/anti-6xHis հակամարմինների համալիրների հակաբիոտինի (streptavidin-HRP) և հակամկների վրա հայտնաբերված Western blot վերլուծություն, որոնք պիտակավորված են զոնդ 3-ով, կախված լույսի ազդեցության ժամանակից:Առանձին սպիտակուցների պիտակները արտահայտված են համապատասխան մոլեկուլային քաշով՝ LC հակամարմինների թեթև շղթա, HC հակամարմինների ծանր շղթա:Այս փորձերը ինքնուրույն կրկնվել են առնվազն երկու անգամ՝ նմանատիպ արդյունքներով:
Պիտակավորման վայրի կենսաքիմիական ստուգման համար զանգվածային սպեկտրոմետրիայի միջոցով հայտնաբերված PRDX3-ը և PRDX1-ը փոխվել են հիստիդինից ալանինի և համեմատվել են վայրի տեսակի հետ տրանսֆեկցիոն փորձարկումներում:PDPL-ի արդյունքները ցույց են տվել, որ մուտացիան զգալիորեն նվազեցրել է պիտակավորումը (նկ. 2դ):Միևնույն ժամանակ, բաց որոնման ընթացքում հայտնաբերված պեպտիդային հաջորդականությունները սինթեզվեցին և արձագանքեցին in vitro զտված miniSOG-ի հետ՝ զոնդ 3-ի և կապույտ լույսի առկայության դեպքում՝ LC-MS-ով հայտնաբերելիս ստանալով ապրանքներ +247 և +229 Da զանգվածային տեղաշարժով (նկ. 2e).)Փորձելու համար, թե արդյոք փոխազդող պրոքսիմալ սպիտակուցները կարող են պիտակավորվել in vitro՝ ի պատասխան miniSOG ֆոտոակտիվացման, մենք նախագծեցինք արհեստական ​​մոտիկության փորձարկում՝ miniSOG-6xHis սպիտակուցի և հակա-His մոնոկլոնալ հակամարմինի միջև in vitro փոխազդեցությամբ (Նկար 2f):Այս վերլուծության մեջ մենք ակնկալում էինք հակամարմինների ծանր և թեթև շղթաների պրոքսիմալ պիտակավորում miniSOG-ով:Իրականում, հակամկնիկի (ճանաչելով anti-6xHis-ով պիտակավորված հակամարմինների ծանր և թեթև շղթաները) և streptavidin Western blots-ը ցույց տվեց ծանր և թեթև շղթաների ուժեղ բիոտինիլացում:Հատկանշական է, որ մենք նկատեցինք miniSOG ավտոբիոտինիլացում 6xHis պիտակի և թեթև և ծանր շղթաների միջև խաչաձև կապերի պատճառով, ինչը կարող է կապված լինել լիզինի և 2-օքսո-հիստիդինի պրոքսիմալ արձագանքի միջև նախկինում նկարագրված բացվածքի հետ:Եզրափակելով, մենք եզրակացնում ենք, որ PDPL-ն փոփոխում է հիստիդինը մոտիկությունից կախված եղանակով:
Մեր հաջորդ նպատակն էր բնութագրել ենթաբջջային պրոտեոմը՝ in situ պիտակավորման առանձնահատկությունը ստուգելու համար:Հետևաբար, մենք կայունորեն արտահայտեցինք miniSOG-ը HEK293T բջիջների միջուկում, միտոքոնդրիալ մատրիցում կամ արտաքին ER թաղանթում (նկ. 3ա):Գելի ֆլուորեսցենտային վերլուծությունը բացահայտեց առատ պիտակավորված ժապավեններ երեք ենթաբջջային վայրերում, ինչպես նաև տարբեր պիտակավորման ձևեր (նկ. 3b):Ֆլյուորեսցենտային պատկերային վերլուծությունը ցույց է տվել PDPL-ի բարձր սպեցիֆիկությունը (նկ. 3c):PDPL-ի աշխատանքի ընթացքին հետևեցին ռոդամինային ներկերի հետ սեղմման ռեակցիաները՝ ֆլյուորեսցենտային մանրադիտակի միջոցով ենթաբջջային պրոտեոմները ուրվագծելու համար, և PDPL ազդանշանները համակցվեցին DAPI-ի, միտոքոնդրիալ հետքերով կամ ER-հետքերով՝ հաստատելով PDPL-ի բարձր հավատարմությունը:Օրգանելների երեք տեղակայման համար PDPL-ի կողք կողքի համեմատությունը TurboID-ի հետ՝ օգտագործելով ավիդին վեսթերն բլոտը, ցույց տվեց, որ PDPL-ն ավելի կոնկրետ պիտակավորված էր՝ համեմատած իրենց համապատասխան հսկիչների հետ:PDPL-ի պայմաններում հայտնվեցին ավելի շատ պիտակավորված ժապավեններ, որոնք ցույց էին տալիս ավելի շատ PDPL պիտակավորված սպիտակուցներ (Լրացուցիչ նկ. 6ա-դ):
miniSOG միջնորդավորված օրգանելներին հատուկ պրոտեոմի պիտակավորման սխեմատիկ ներկայացում:miniSOG-ը թիրախավորում է միտոքոնդրիալ մատրիցը մարդկային COX4-ի N-տերմինալ 23 ամինաթթուների հետ միաձուլման միջոցով (mito-miniSOG), միջուկը միաձուլման միջոցով H2B-ին (միջուկ-miniSOG), իսկ Sec61β-ը՝ ER մեմբրանի ցիտոպլազմային կողմի միջոցով (ER-miniSOG): )Ցուցումները ներառում են գելային պատկերացում, կոնֆոկալ պատկերացում և զանգվածային սպեկտրոմետրիա:b Երեք օրգանելներին հատուկ PDPL պրոֆիլների ներկայացուցչական գել պատկերներ:CBB Coomassie Brilliant Blue.գ HEK293T բջիջների ներկայացուցչական կոնֆոկալ պատկերներ, որոնք կայունորեն արտահայտում են miniSOG տարբեր ենթաբջջային տեղայնացումներով, որոնք հայտնաբերվել են V5 պիտակավորված հակամարմիններով (կարմիր):Ենթաբջջային մարկերներ օգտագործվում են միտոքոնդրիաների և ԷՌ-ի համար (կանաչ):PDPL աշխատանքային հոսքը ներառում է miniSOG (դեղին) պիտակավորված ենթաբջջային պրոտեոմների հայտնաբերում Cy3-azide click քիմիայի միջոցով:Սանդղակի սանդղակ՝ 10 մկմ:դ PDPL պիտակավորված պրոտեոմների հրաբխային գծապատկերներ տարբեր օրգանելներում, որոնք քանակականացվել են չպիտակավորված քանակականացմամբ (n = 3 անկախ կենսաբանական փորձեր):Հրաբխային հողամասերի վրա կիրառվել է երկու պոչ ուսանողի t-թեստ:Որպես բացասական հսկողություն օգտագործվել է HEK293T վայրի տեսակը: Զգալիորեն փոփոխված սպիտակուցներն ընդգծված են կարմիրով (p <0,05 և >2 անգամ իոնների ինտենսիվության տարբերություն): Զգալիորեն փոփոխված սպիտակուցներն ընդգծված են կարմիրով (p <0,05 և >2 անգամ իոնների ինտենսիվության տարբերություն): Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов). Զգալիորեն փոփոխված սպիտակուցներն ընդգծված են կարմիրով (p <0.05 և >2 անգամ տարբերություն իոնների ինտենսիվության մեջ):显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). Զգալիորեն փոփոխված սպիտակուցներն ընդգծված են կարմիրով (p <0,05 և > 2 անգամ տարբերություն իոնային ուժի մեջ):Հարակից սպիտակուցները, որոնք կարևոր են HEK293T-miniSOG-ի համար, բայց ոչ կարևոր HEK293T-ի համար, ցուցադրվում են կանաչ գույնով:ե Փորձերի պրոտեոմային տվյալների հավաքածուների առանձնահատկությունների վերլուծություն դ.Վերևում նշված է վիճակագրորեն նշանակալի սպիտակուցների ընդհանուր թիվը յուրաքանչյուր օրգանելում (կարմիր և կանաչ կետեր):Հիստոգրամները ցույց են տալիս օրգանելներում տեղայնացված սպիտակուցներ, որոնք հիմնված են MitoCarta 3.0, GO վերլուծության և A. Ting et al.Ժողովուրդ.Առանձին տվյալների հավաքածուներ միտոքոնդրիաների, միջուկների և ER-ի համար:Այս փորձերը ինքնուրույն կրկնվել են առնվազն երկու անգամ՝ նմանատիպ արդյունքներով:Հում տվյալները տրամադրվում են չմշակված տվյալների ֆայլերի տեսքով:
Խրախուսված գելից և պատկերման արդյունքներից՝ առանց պիտակի քանակական հաշվարկն օգտագործվել է յուրաքանչյուր օրգանելում հայտնաբերված պրոտեոմը քանակականացնելու համար (Լրացուցիչ տվյալներ 2):Չփոխանցված HEK293T-ն օգտագործվել է որպես բացասական հսկողություն՝ ֆոնային մարկերները հանելու համար: Հրաբխի սյուժեի վերլուծությունը ցույց տվեց զգալիորեն հարստացված սպիտակուցներ (p <0,05 և >2 անգամ իոնային ինտենսիվություն), ինչպես նաև միանգամյա սպիտակուցներ, որոնք առկա են միայն miniSOG-արտահայտող գծերում (նկ. 3d կարմիր և կանաչ կետեր): Հրաբխի սյուժեի վերլուծությունը ցույց տվեց զգալիորեն հարստացված սպիտակուցներ (p <0,05 և >2 անգամ իոնային ինտենսիվություն), ինչպես նաև միանգամյա սպիտակուցներ, որոնք առկա են միայն miniSOG-արտահայտող գծերում (նկ. 3d կարմիր և կանաչ կետեր): Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, ирисыю3, экспреси. Հրաբխի սյուժեի վերլուծությունը ցույց տվեց զգալիորեն հարստացված սպիտակուցներ (p<0.05 և >2 անգամ իոնային ինտենսիվություն), ինչպես նաև առանձին սպիտակուցներ, որոնք առկա են միայն մինիՍՕԳ արտահայտող գծերում (նկ. 3d, կարմիր և կանաչ կետեր):火山图 分析 出 显着 富集 的 蛋白质 的 蛋白质 倍 离子 强度) 以及 倍 存 在于 Minisog 表达 系 中 的 单一单一 (图 3D 红色红色和):火山图 显示 出 显着 的 蛋白质 (p <0.05 和> 2 倍 离子 强度) 仅仅 在于 在于 表达 系 的 单一 单一 (图 3D 红色 绿色点 ...))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))) Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные линии miniSOG) (красны). Հրաբխի սյուժեի վերլուծությունը բացահայտեց զգալիորեն հարստացված սպիտակուցներ (p<0.05 և >2x իոնային ուժ), ինչպես նաև միայնակ սպիտակուցներ, որոնք առկա են միայն miniSOG արտահայտման գծում (կարմիր և կանաչ կետեր Նկար 3d-ում):Համակցելով այս տվյալները՝ մենք հայտնաբերեցինք համապատասխանաբար 1364, 461 և 911 վիճակագրորեն նշանակալի միջուկային, միտոքոնդրիալ և ER արտաքին թաղանթի սպիտակուցներ:Օրգանելներով տեղայնացված PDPL-ի ճշգրտությունը վերլուծելու համար մենք օգտագործեցինք MitoCarta 3.0, Gene Ontology (GO) վերլուծությունը և A. Ting et al.տվյալների հավաքածու8 օգտագործվել է միտոքոնդրիայի, միջուկի և ER-ի համար՝ հայտնաբերված սպիտակուցների օրգանելային յուրահատկությունը ստուգելու համար, որը համապատասխանում է 73.4, 78.5 և 73.0% ճշգրտությանը (նկ. 3e):PDPL-ի առանձնահատկությունը հաստատում է, որ PDPL-ն իդեալական գործիք է օրգանելներին հատուկ պրոտեոմների նույնականացման համար:Հատկանշական է, որ նույնականացված միտոքոնդրիումային սպիտակուցների ենթակայության վերլուծությունը ցույց է տվել, որ թակարդված պրոտեոմը հիմնականում բաշխված է մատրիցայում և ներքին թաղանթում (համապատասխանաբար 226 և 106), ինչը կազմում է հայտնաբերված միտոքոնդրիումային սպիտակուցների ընդհանուր թվի 91,7%-ը (362):PDPL-ի բարձր մակարդակը լրացուցիչ հաստատվել է (Լրացուցիչ Նկար 7ա):Նմանապես, ենթամիջուկային վերլուծությունը ցույց տվեց, որ գրավված պրոտեոմը հիմնականում բաշխված է միջուկում, նուկլեոպլազմում և նուկլեոլում (Լրացուցիչ նկար 7b):Միջուկային պրոտեոմիկ անալիզը միջուկային տեղայնացման ազդանշանային պեպտիդով (3xNLS) ցույց է տվել H2B կառուցվածքի նման ճշգրտություն (Լրացուցիչ նկ. 7c–h):PDPL մարկերի առանձնահատկությունը որոշելու համար միջուկային լամինին A-ն ընտրվել է որպես ավելի հստակ տեղայնացված POI7 թակարդ:PDPL-ը հայտնաբերել է զգալիորեն հարստացված 36 սպիտակուցներ, որոնցից 12 սպիտակուցներ (30.0%-ը ներառյալ լամին A-ն) լավ բնութագրված լամին A փոխազդող սպիտակուցներ են՝ ծանոթագրված String տվյալների բազայի կողմից, ավելի բարձր տոկոսով, քան BioID մեթոդը (122 սպիտակուց) 28-ից 28, 22.9: %) 7. Մեր մեթոդը հայտնաբերեց ավելի քիչ սպիտակուցներ, հնարավոր է, սահմանափակ պիտակավորման տարածքների պատճառով, ինչը հնարավոր դարձավ ավելի ակտիվ միալար թթվածնի շնորհիվ:GO վերլուծությունը ցույց է տվել, որ հայտնաբերված սպիտակուցները հիմնականում տեղակայված են եղել նուկլեոպլազմում (26), միջուկային թաղանթում (10), միջուկային թաղանթում (9) և միջուկային ծակոտիներում (5):Հավաքականորեն, այս միջուկային տեղայնացված սպիտակուցները կազմում էին հարստացված սպիտակուցների 80%-ը՝ հետագայում ցույց տալով PDPL-ի առանձնահատկությունը (Լրացուցիչ նկար 8ա–դ):
Հաստատելով PDPL-ի կարողությունը՝ կատարել մերձավորության նշագծում օրգանելներում, մենք այնուհետև փորձարկեցինք, թե արդյոք PDPL-ը կարող է օգտագործվել POI կապող գործընկերները վերլուծելու համար:Մասնավորապես, մենք ձգտել ենք սահմանել ցիտոզոլային սպիտակուցների PDPL վերլուծությունը, որոնք իրենց բարձր դինամիկ բնույթի պատճառով համարվում են ավելի բարդ թիրախներ, քան իրենց թաղանթային տեղայնացված գործընկերները:Բրոմոդոմենը և արտատերմինալ (BET) BRD4 սպիտակուցը գրավել է մեր ուշադրությունը տարբեր հիվանդությունների ժամանակ իր առանցքային դերի համար 35, 36:BRD4-ի կողմից ձևավորված համալիրը տրանսկրիպցիոն կոակտիվատոր է և կարևոր թերապևտիկ թիրախ:Կարգավորելով c-myc և Wnt5a տրանսկրիպցիոն գործոնների արտահայտումը, ենթադրվում է, որ BRD4-ը հանդիսանում է սուր միելոիդ լեյկեմիայի (ԱՄԼ), բազմակի միելոմայի, Բուրկիթի լիմֆոմայի, հաստ աղիքի քաղցկեղի և բորբոքային հիվանդությունների հիմնական որոշիչը37,38:Բացի այդ, որոշ վիրուսներ ուղղված են BRD4-ին՝ վիրուսների և բջջային տրանսկրիպցիան կարգավորելու համար, ինչպիսիք են պապիլոմավիրուսը, ՄԻԱՎ-ը և SARS-CoV-236,39-ը:
BRD4-ի փոխազդեցությունը PDPL-ի միջոցով քարտեզագրելու համար մենք միավորեցինք miniSOG-ը BRD4-ի կարճ N- կամ C-տերմինալ իզոֆորմի հետ:Պրոտեոմիկ արդյունքները բացահայտեցին երկու կոնստրուկտների միջև համընկնման բարձր աստիճան (Լրացուցիչ նկ. 9ա):Միջուկային պրոտեոմը, որը նույնացվում է miniSOG-H2B-ով, ընդգրկում է BRD4-ի հետ փոխազդող սպիտակուցների 77,6%-ը (Լրացուցիչ նկար 9b):Այնուհետև, լուսավորության տարբեր ժամանակներ (2, 5, 10, 20 րոպե) օգտագործվել են մարկերի շառավիղը կարգավորելու համար (նկ. 4ա և լրացուցիչ տվյալներ 3):Մենք եզրակացնում ենք, որ ավելի կարճ ֆոտոպերիոդների դեպքում PDPL-ը հիմնականում կնշի ուղղակի կապող գործընկերներին, մինչդեռ ավելի երկար ժամանակահատվածները կներառեն սպիտակուցներ, որոնք հայտնաբերված են ավելի կարճ ֆոտոակտիվացման ժամանակաշրջաններում, ինչպես նաև անուղղակի թիրախներ պիտակավորման համալիրներում:Փաստորեն, մենք գտանք ուժեղ համընկնումներ հարակից ժամանակային կետերի միջև (84.6% 2 և 5 րոպե; 87.7% 5 և 10 րոպե; 98.7% 10 և 20 րոպե) (նկ. 4b և լրացուցիչ Նկար 9c):Բոլոր փորձարարական խմբերում մենք գտանք ոչ միայն BRD4-ի ինքնապիտակավորումը, այլև մի քանի հայտնի թիրախներ, ինչպիսիք են MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A և HMGB1, ծանոթագրված լարային տվյալների բազայում:Այս թիրախների իոնային ուժը համաչափ է ազդեցության ժամանակին (նկ. 4c և լրացուցիչ նկ. 9դ):2 րոպեանոց խմբում հայտնաբերված սպիտակուցների GO վերլուծությունը ցույց է տվել, որ հայտնաբերված սպիտակուցները տեղայնացված են միջուկում և ներգրավված են քրոմատինի վերափոխման և ՌՆԹ պոլիմերազի ֆունկցիայի մեջ:Սպիտակուցի մոլեկուլային ֆունկցիան հարստացել է քրոմատինի կապակցմամբ կամ տրանսկրիպցիոն կոակտիվացմամբ՝ համահունչ BRD4 ֆունկցիային (նկ. 4d):Լարային տվյալների բազայի միջոցով սպիտակուցների փոխազդեցության վերլուծությունը բացահայտեց անուղղակի փոխազդեցության առաջին մակարդակը BRD4-ի և HDAC ընտանիքի փոխազդող համալիրների միջև, ինչպիսիք են SIN3A, NCOR2, BCOR և SAP130 (նկ. 4e և լրացուցիչ Նկար 9e), որը համապատասխանում է BRD4 և HDAC կապող ացետիլացված հիստոններին: ..Բացի այդ, LC-MS/MS-ի կողմից հայտնաբերված ներկայացուցչական թիրախները, ներառյալ Sin3A, NSUN2, Fus և SFPQ, հաստատվել են Western blotting-ով (նկ. 4f):Վերջերս հաղորդվել է, որ BRD4-ի կարճ իզոֆորմը ձևավորում է միջուկներ՝ հեղուկ-հեղուկ փուլային տարանջատման (LLPS) հատկություններով:ՌՆԹ-ն կապող Fus և SFPQ սպիտակուցները միջնորդում են տարբեր բջջային պրոցեսների LLPS-ը և այստեղ ճանաչվել են որպես չգրանցված BRD4 կապող սպիտակուցներ:BRD4-ի և SFPQ-ի փոխազդեցությունը հաստատվել է համատեղ իմունային տեղումների (co-IP) փորձերի միջոցով (Նկար 4g)՝ առաջարկելով BRD4-ով միջնորդավորված հեղուկ-հեղուկ փուլի տարանջատման այլ մեխանիզմ, որն արժանի է հետագա հետաքննության:Միասին այս արդյունքները ցույց են տալիս, որ PDPL-ն իդեալական հարթակ է հայտնի BRD4 փոխազդող, ինչպես նաև անհայտ կապող սպիտակուցների նույնականացման համար:
miniSOG միջնորդավորված BRD4 հարևանության գծանշման սխեմատիկ ներկայացում, ազդեցության ժամանակները՝ 2, 5, 10 և 20 րոպե:բ Լուսավորման տարբեր ժամանակներում հայտնաբերված սպիտակուցների համընկնումը:HEK293T-miniSOG-BRD4-ում հայտնաբերված սպիտակուցի հարստացումը վիճակագրորեն նշանակալի էր վայրի տիպի HEK293T-ի համեմատ:գ Իոնների ինտենսիվությունը, երբ որոշվում են չպիտակավորված ներկայացուցչական հայտնի BRD4-կապող սպիտակուցները նշված ազդեցության ժամանակի ընթացքում:n = 3 կենսաբանորեն անկախ նմուշներ:Տվյալները ներկայացված են որպես միջին ± ստանդարտ շեղում:դ 2 րոպեանոց խմբում հայտնաբերված սպիտակուցների գենային գոյաբանական վերլուծություն (GO):Առաջին տասը GO տերմինները թվարկված են:Փուչիկները գունավորվում են ըստ GO տերմինի կատեգորիայի, և պղպջակների չափը համաչափ է յուրաքանչյուր տերմինում հայտնաբերված սպիտակուցների քանակին:ե BRD4-ի հետ փոխազդող սպիտակուցների լարային վերլուծություն:Դեղին շրջանակները ուղղակի սոսինձ են, իսկ մոխրագույն շրջանակները անուղղակի սոսինձի առաջին շերտն են:Կարմիր գծերը ներկայացնում են փորձարարորեն որոշված ​​փոխազդեցությունները, իսկ կապույտ գծերը ներկայացնում են կանխատեսված փոխազդեցությունները:f LC-MS/MS-ում հայտնաբերված BRD4 պարտադիր թիրախները ստուգվել են Western blotting-ով:g Համատեղ իմունային տեղումների փորձերը հաստատում են SFPQ-ի և BRD4-ի փոխազդեցությունը:Այս փորձերը ինքնուրույն կրկնվել են առնվազն երկու անգամ՝ նմանատիպ արդյունքներով:Հում տվյալները տրամադրվում են չմշակված տվյալների ֆայլերի տեսքով:
Ի հավելումն չգրանցված POI-ի հետ կապված թիրախների բացահայտմանը, մենք ենթադրում ենք, որ PDPL-ը հարմար կլինի ֆերմենտների համար սուբստրատների նույնականացման համար, ինչը կպահանջի մեծ համալիրներում անուղղակի կապող սպիտակուցների բնութագրում՝ չգրանցված սուբստրատները նշելու համար:Պարկինը (կոդավորված PARK2-ով) E3 լիգազ է, և հայտնի է, որ պարկինի մուտացիաները առաջացնում են աուտոսոմային ռեցեսիվ անչափահաս Պարկինսոնի հիվանդություն (AR-JP)42:Բացի այդ, պարկինը նկարագրվել է որպես կարևոր միտոֆագիայի (միտոքոնդրիալ աուտոֆագիա) և թթվածնի ռեակտիվ տեսակների հեռացման համար:Այնուամենայնիվ, թեև հայտնաբերվել են պարկինի մի քանի սուբստրատներ, պարկինի դերն այս հիվանդության մեջ մնում է անհասկանալի:Իր չբնութագրված ենթաշերտերը ծանոթագրելու համար PDPL-ն փորձարկվել է՝ ավելացնելով miniSOG պարկինի N- կամ C-վերնամասին:Բջիջները մշակվել են կարբոնիլ ցիանիդային պրոտոն փոխադրող մ-քլորոֆենիլհիդրազոնով (CCCP)՝ PINK1-Parkin ուղու միջոցով պարկինը ակտիվացնելու համար:Համեմատած մեր BRD4 PDPL արդյունքների հետ, պարկինի N-տերմինալի միաձուլումը բացահայտեց թիրախային սպիտակուցների ավելի մեծ շարք, թեև այն ծածկում էր C-տերմինալի ավելի մեծ մասը (177-ը 210-ից) (Նկար 5a,b և լրացուցիչ տվյալներ 4):Արդյունքը համահունչ է այն հաղորդումներին, որ N-տերմինալ պիտակները կարող են անկանոն կերպով ակտիվացնել Parkin44-ը:Զարմանալիորեն, մեր տվյալների մեջ կային ընդամենը 18 համընկնող սպիտակուցներ՝ հրապարակված AP-MS արդյունքներով Parkin43-ի համար, հավանաբար բջջային գծերի և պրոտեոմիկայի աշխատանքային հոսքերի միջև եղած տարբերությունների պատճառով:Ի հավելումն չորս հայտնի սպիտակուցների (ARDM1, HSPA8, PSMD14 և PSMC3), որոնք նույնականացվել են երկու մեթոդներով (նկ. 5c)43:LC-MS/MS-ի արդյունքները հետագա վավերացնելու համար PDPL բուժումը և հետագա Western blotting-ը օգտագործվել են՝ համեմատելու HEK293T մայր բջիջների հետազոտության և կայուն N-տերմինալ պարկինային գծի արդյունքները:Նախկինում անհայտ թիրախները CDK2, DUT, CTBP1 և PSMC4 փորձարկվել են հայտնի կապակցիչով՝ DNAJB1-ով (նկ. 5d):
Պարկինի հետ փոխազդող սպիտակուցների հրաբխային գծապատկեր HEK293T բջիջներում կայուն արտահայտված miniSOG-ով միաձուլված պարկինի N- կամ C-վերնամասին (n = 3 անկախ կենսաբանական փորձ):Հրաբխային հողամասերի վրա կիրառվել է երկու պոչ ուսանողի t-թեստ:HEK293T-ն օգտագործվել է որպես բացասական հսկողություն: Զգալիորեն փոփոխված սպիտակուցներն ընդգծված են կարմիրով (p <0,05 և >2 անգամ իոնների ինտենսիվության տարբերություն): Զգալիորեն փոփոխված սպիտակուցներն ընդգծված են կարմիրով (p <0,05 և >2 անգամ իոնների ինտենսիվության տարբերություն): Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов). Զգալիորեն փոփոխված սպիտակուցներն ընդգծված են կարմիրով (p <0.05 և >2 անգամ տարբերություն իոնների ինտենսիվության մեջ):显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). Զգալիորեն փոփոխված սպիտակուցներն ընդգծված են կարմիրով (p <0,05 և > 2 անգամ տարբերություն իոնային ուժի մեջ):Հարակից սպիտակուցները, որոնք կարևոր են HEK293T-miniSOG-ի համար, բայց ոչ կարևոր HEK293T-ի համար, ցուցադրվում են կանաչ գույնով:b Վենի դիագրամ, որը ցույց է տալիս N-տերմինալ և C-տերմինալ կառուցվածքների միջև համընկնող սպիտակուցներ:N-տերմինալ պիտակները կարող են անկանոն կերպով ակտիվացնել պարկինը և հանգեցնել ավելի ճանաչելի սպիտակուցների:գ Վենի դիագրամ, որը ցույց է տալիս PDPL-ի և AP-MS-ի միջև համընկնող սպիտակուցները:Թվարկված են հայտնի փոխազդեցությունները, ներառյալ 18 համընկնող սպիտակուցներից 4-ը և PDPL-ում հատուկ հայտնաբերված 159 սպիտակուցներից 11-ը:դ LC-MS/MS-ի կողմից հայտնաբերված ներկայացուցչական թիրախները ստուգվել են Western blotting-ով:e Ssu72-ը և SNW1-ը նույնականացվել են որպես չգրանցված պարկինային ենթաշերտեր:Այս FLAG-ով պիտակավորված սպիտակուցային պլազմիդները տրանսֆեկցվեցին HEK293T և HEK293T-Parkin-miniSOG-ի մեջ, որին հաջորդեց CCCP բուժումը տարբեր ժամանակային կետերում:Դեգրադացիան ավելի ցայտուն էր Պարկինի գերարտահայտման գծում:f Օգտագործելով MG132 պրոթեզոմի ինհիբիտորը, հաստատվեց, որ Ssu72-ի և SNW1-ի քայքայման գործընթացը միջնորդվում է պրոտեազոմ-ուբիկվիտինացիայի միջոցով:Այս փորձերը ինքնուրույն կրկնվել են առնվազն երկու անգամ՝ նմանատիպ արդյունքներով:Հում տվյալները տրամադրվում են չմշակված տվյալների ֆայլերի տեսքով:
Հատկանշական է, որ PDPL-ի կողմից հայտնաբերված սպիտակուցները պետք է ներառեն պարկին կապող սպիտակուցներ և դրանց սուբստրատները:Չգրանցված պարկինային սուբստրատները հայտնաբերելու համար մենք ընտրեցինք յոթ նույնականացված սպիտակուցներ (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 և SNW1) և փոխարկեցինք պլազմիդները՝ այս գեները նորմալ HEK293T-ին ենթարկելու և կայունորեն արտահայտելու miniSOG-Parkin's33T-ի HEK2 բուժումը:Ssu72 և SNW1 սպիտակուցների մակարդակները զգալիորեն նվազել են կայուն miniSOG-Parkin գծում (նկ. 5e):12 ժամվա ընթացքում CCCP-ով բուժումը հանգեցրեց երկու սուբստրատների ամենազգալի դեգրադացմանը:Հետաքննելու համար, թե արդյոք Ssu72-ի և SNW1-ի դեգրադացիան կարգավորվում է պրոտեազոմ-ուբիկվիտինացիայով, պրոթեզոմային արգելակիչ MG132 ավելացվել է պրոթեզոմի ակտիվությունը արգելակելու համար, և իրականում մենք պարզեցինք, որ դրանց քայքայման գործընթացը արգելակված է (նկ. 5f):Լրացուցիչ ոչ սուբստրատային թիրախները հաստատվել են որպես Պարկինի փոխազդեցություններ՝ օգտագործելով Western blotting (Լրացուցիչ Նկար 10), որը ցույց է տվել հետևողական արդյունքներ LC-MS/MS-ի հետ:Եզրափակելով, PDPL աշխատանքային հոսքի ինտեգրումը թիրախային սպիտակուցի տրանսֆեկցիայի ստուգման հետ թույլ է տալիս նույնականացնել չգրանցված E3 լիգազի սուբստրատները:
Մենք մշակել ենք ընդհանուր հարևանության գծանշման հարթակ, որը թույլ է տալիս բացահայտել տարածության և ժամանակի մեջ փոխազդող POI-ները:Պլատֆորմը հիմնված է miniSOG ֆոտոզգայուն պրոտեինի վրա, որը կազմում է ընդամենը մոտ 12 կԴա՝ հասուն APEX2 ֆերմենտի (27 կԴա) չափի կեսից պակաս և TurboID-ի (35 կԴա) չափի մեկ երրորդը:Ավելի փոքր չափը պետք է մեծապես ընդլայնի փոքր սպիտակուցային ինտերակտոմների ուսումնասիրման կիրառությունների շրջանակը:Լրացուցիչ ֆոտոզգայունացուցիչների հետագա ուսումնասիրությունը՝ լինեն գենետիկորեն կոդավորված սպիտակուցներ, թե փոքր մոլեկուլներ, անհրաժեշտ է թթվածնի քվանտային ելքը մեծացնելու և այս մոտեցման զգայունությունը ընդլայնելու համար:miniSOG-ի ընթացիկ տարբերակի համար բարձր ժամանակային լուծում կարելի է ձեռք բերել կապույտ լուսավորության միջոցով՝ հարևանության ցուցիչները ակտիվացնելու համար:Ի հավելումն, ավելի երկար ազդեցության ժամանակը թողարկեց միանգամյա թթվածնի ավելի մեծ «ամպ», որի արդյունքում փոփոխվեցին ավելի հեռավոր հիստիդինի մնացորդները, ավելացվեց պիտակավորման շառավիղը և PDPL տարածական լուծաչափը ճշգրտելու կարողությունը:Մենք նաև փորձարկեցինք յոթ քիմիական զոնդ՝ ազդանշան-ֆոն հարաբերակցությունը մեծացնելու համար և ուսումնասիրեցինք այս մոտեցման հետևում գտնվող մոլեկուլային մեխանիզմը:TOP-ABPP-ի աշխատանքային հոսքը՝ զուգորդված անկողմնակալ բաց որոնման հետ, հաստատեց, որ փոփոխություններ են տեղի ունեցել միայն հիստիդիններում, և ոչ մի հետևողական միկրոմիջավայր չի նկատվել հիստիդինի աճող փոփոխությունների համար, բացառությամբ հանգույցի շրջանում հիստիդինների չափավոր նախապատվության:
PDPL-ը նաև օգտագործվել է ենթաբջջային պրոտեոմները բնութագրելու համար պրոտեոմի յուրահատկությամբ և ծածկույթով առնվազն համեմատելի այլ հարևանության պիտակավորման և օրգանելներին հատուկ քիմիական հետազոտման մեթոդների հետ:Հարևանության մարկերները նույնպես հաջողությամբ օգտագործվել են մակերեսը, լիզոսոմային և սեկրետոմի հետ կապված պրոտեոմները բնութագրելու համար46,47:Մենք հավատում ենք, որ PDPL-ը համատեղելի կլինի այս ենթաբջջային օրգանելների հետ:Ի լրումն, մենք մարտահրավեր նետեցինք PDPL-ին՝ բացահայտելով ցիտոզոլային սպիտակուցների միացման թիրախները, որոնք ավելի բարդ են, քան մեմբրանի հետ կապված սպիտակուցները՝ իրենց դինամիկ հատկությունների և ավելի ժամանակավոր փոխազդեցությունների մեջ ներգրավվածության պատճառով:PDPL-ը կիրառվել է երկու սպիտակուցների՝ տրանսկրիպցիոն կոակտիվատորի BRD4-ի և հիվանդության հետ կապված լիգազի E3 Parkin-ի վրա:Այս երկու սպիտակուցներն ընտրվել են ոչ միայն իրենց հիմնարար կենսաբանական ֆունկցիաների, այլ նաև կլինիկական նշանակության և բուժական ներուժի համար:Այս երկու POI-ների համար բացահայտվել են հայտնի պարտադիր գործընկերներ, ինչպես նաև չգրանցված թիրախներ:Հատկանշական է, որ փուլային տարանջատման հետ կապված SFPQ սպիտակուցը հաստատվել է co-IP-ով, որը կարող է ցույց տալ նոր մեխանիզմ, որով BRD4-ը (կարճ իզոֆորմը) կարգավորում է LLPS-ը:Միևնույն ժամանակ, մենք կարծում ենք, որ Պարկինի սուբստրատների նույնականացումը մի սցենար է, որի դեպքում պահանջվում է անուղղակի սոսինձների նույնականացում:Մենք հայտնաբերեցինք երկու անհայտ պարկինային սուբստրատներ և հաստատեցինք դրանց քայքայումը ուբիկվիտինացիա-պրոտեզոմային ճանապարհով:Վերջերս մշակվել է մեխանիզմի վրա հիմնված թակարդման ռազմավարություն՝ հայտնաբերելու հիդրոլազային սուբստրատները՝ դրանք թակարդելով ֆերմենտներով:Թեև սա շատ հզոր մեթոդ է, այն հարմար չէ խոշոր կոմպլեքսների ձևավորման մեջ ներգրավված սուբստրատների վերլուծության համար և պահանջում է ֆերմենտի և սուբստրատի միջև կովալենտային կապերի ձևավորում:Մենք ակնկալում ենք, որ PDPL-ը կարող է ընդլայնվել՝ ուսումնասիրելու այլ սպիտակուցային բարդույթներ և ֆերմենտային ընտանիքներ, ինչպիսիք են դեուբիկվիտինազների և մետալոպրոտեազների ընտանիքները:
miniSOG-ի նոր ձևը, որը կոչվում է SOPP3, մշակվել է միանգամյա թթվածնի արտադրության բարելավմամբ:Մենք համեմատեցինք miniSOG-ը SOPP3-ի հետ և հայտնաբերեցինք մակնշման բարելավված կատարում, թեև ազդանշան-աղմուկ հարաբերակցությունը մնաց անփոփոխ (Լրացուցիչ նկար 11):Մենք ենթադրեցինք, որ SOPP3-ի օպտիմալացումը (օրինակ՝ ուղղորդված էվոլյուցիայի միջոցով) կհանգեցնի ավելի արդյունավետ լուսազգայուն սպիտակուցների, որոնք պահանջում են ավելի կարճ լույսի ժամանակներ և այդպիսով թույլ կտան ավելի դինամիկ բջջային պրոցեսներ գրավել:Հատկանշական է, որ PDPL-ի ներկայիս տարբերակը սահմանափակված է բջջային միջավայրով, քանի որ այն պահանջում է կապույտ լույսի լուսավորություն և չի կարող թափանցել խորը հյուսվածքներ:Այս հատկանիշը բացառում է դրա օգտագործումը կենդանիների մոդելների ուսումնասիրություններում:Այնուամենայնիվ, օպտոգենետիկայի համադրությունը PDPL-ի հետ կարող է հնարավորություն ընձեռել կենդանիների հետազոտության համար, հատկապես ուղեղում:Բացի այդ, այլ մշակված ինֆրակարմիր ֆոտոզգայունացուցիչները նույնպես վերացնում են այս սահմանափակումը:Ներկայումս այս ոլորտում կատարվում են հետազոտություններ:
HEK293T բջջային գիծը ստացվել է ATCC-ից (CRL-3216):Բջջային գիծը բացասական է եղել միկոպլազմայի վարակի համար և մշակվել է DMEM-ում (Thermo, #C11995500BT), որը լրացվում է 10% պտղի եղջերավոր շիճուկով (FBS, Vistech, #SE100-B) և 1% պենիցիլինի/streptomycin (Hyclone, #SV30010):մեծացել է.
3-ամինոֆենիլեն (նմուշ 3) և (4-էթինիլֆենիլ)մեթանամին (նմուշ 4) գնվել են Bidepharm-ից:Propylamine (զոնդ 2) գնվել է Energy-chemicals ընկերությունից:N-(2-Ամինոֆենիլ)պենտ-4-ինամիդը (զոնդ 1) սինթեզվել է ըստ հրապարակված մեթոդների։
Լրացուցիչ Աղյուսակ 1-ում թվարկված են այս ուսումնասիրության մեջ օգտագործված գենետիկական կառուցվածքները:miniSOG և KillerRed հաջորդականությունները կլոնավորվել են P. Zou-ի նվեր պլազմիդից (Պեկինի համալսարան):Միտոքոնդրիալ մատրիցային թիրախավորման հաջորդականությունը ստացվել է COX4-ի 23 N-տերմինալ ամինաթթուներից և կլոնավորվել նշված վեկտորների մեջ՝ օգտագործելով Gibson հավաքածուն (Beyotime, #D7010S):Էնդոպլազմիկ ցանցի թաղանթն ու միջուկը թիրախավորելու համար SEC61B մարդու ԴՆԹ (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) ուժեղացված է PCR-ով HEK293T բջիջների cDNA գրադարանից և H2B ԴՆԹ (նվիրված է Դ. Լին, Շենժեն Բեյի լաբորատորիա) և կլոնավորված, ինչպես նշվեց վերևում:Եթե ​​այլ բան նշված չէ, այլ սպիտակուցային գեներ, որոնք օգտագործվում են տրանսֆեկցիայի և կայուն բջջային գծերի կառուցման համար, ընդլայնվել են PCR-ով HEK293T բջջային cDNA գրադարանից:G3S (GGGS) և G4S (GGGGS) օգտագործվել են որպես խայծի սպիտակուցի և miniSOG-ի միջև կապողներ:Այս միաձուլման կոնստրուկցիաներին ավելացվել է V5 էպիտոպային պիտակ (GKPIPNPLLGLDST):Կաթնասունների արտահայտման և կայուն բջջային գիծ ստեղծելու համար miniSOG միաձուլման կոնստրուկցիան ենթակլոոնավորվել է pLX304 lentiviral վեկտորի մեջ:Բակտերիաների արտահայտման համար miniSOG-ը կլոնավորվել է pET21a վեկտորի մեջ, որը պիտակավորված է 6xHis C-տերմինալում:
HEK293T բջիջները սերմնացան 2,0 x 105 բջիջներով մեկ հորատանցքում վեց ջրհորի թիթեղներում և 24 ժամ անց տրանսֆեկցվեցին ռեկոմբինանտ լենտիվիրուսային պլազմիդներով (2,4 մկգ pLX304) և վիրուսային փաթեթավորող պլազմիդներով (1,5 մկգ psPAX2 և 1,2 մկգ psPAX2 և 1,2 մկգ psPAX2 և 1,2 մկգ 0Bepo20 ժամանակի օգտագործմամբ pMD20yo): , #C0533), մոտ 80% միաձուլում։Գիշերվա տրանսֆեկցիայից հետո միջավայրը փոխվեց և ինկուբացվեց ևս 24 ժամ:Վիրուսի հավաքագրումն իրականացվել է 24, 48 և 72 ժամ հետո։Նախքան թիրախային բջջային գծերի վարակումը, վիրուսային միջավայրը զտվել է 0,8 մկմ ֆիլտրի միջոցով (Merck, #millex-GP) և պոլիբրենը (Solarbio, #H8761) ավելացվել է մինչև 8 մկգ/մլ կոնցենտրացիա։24 ժամ հետո բջիջներին թույլ են տվել վերականգնվել՝ փոխելով միջավայրը:Բջիջներն ընտրվել են՝ օգտագործելով 5 մկգ/մլ բլաստիցիդին (Solarbio, #3513-03-9) առաջին երեք հատվածների համար՝ որպես ավելի ցածր խիստ ընտրություն:Այնուհետև օգտագործվեց 20 մկգ/մլ՝ որպես ավելի խիստ ռեժիմ հաջորդ երեք հատվածների համար:
Բջիջները ցանվել են 12 ջրհորի խցիկներում (Ibidi, #81201) մոտավորապես 20,000 բջիջ մեկ ջրհորի խտությամբ:HEK293T բջիջների կպչունությունը բարելավելու համար ավելացրեք 50 μg/ml ֆիբրոնեկտին (Corning, #356008)՝ նոսրացված ֆոսֆատով բուֆերացված ֆիզիոլոգիական լուծույթում (PBS, Sangon, #B640435) 37°C-ում:Խցիկները նախապես մշակվել են 1 ժամ, այնուհետև հեռացվել PBS-ով:24 ժամ հետո բջիջները մեկ անգամ լվացվել են PBS-ով, ինկուբացվել են 1 մՄ զոնդով 3 թարմ Հենքսի հավասարակշռված աղի լուծույթում (HBSS, Gibco, #14025092) 1 ժամ 37°C-ում, այնուհետև ինկուբացվել են կապույտ LED-ով (460 նմ): )) ճառագայթվել են 10 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում:Դրանից հետո բջիջները երկու անգամ լվացվեցին PBS-ով և 4% ֆորմալդեհիդով ամրացվեցին PBS-ում (Sangon, #E672002) 15 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում:Ավելորդ ֆորմալդեհիդը հեռացվել է ֆիքսված բջիջներից՝ երեք անգամ լվանալով PBS-ով:Այնուհետև բջիջները թափանցել են 0,5% Triton X-100 (Sangon, #A600198) PBS-ով և 3 անգամ լվանալ PBS-ով:Այնուհետև հանեք խցիկը և յուրաքանչյուր նմուշին ավելացրեք 25 մկլ սեղմման ռեակցիայի խառնուրդ, որը պարունակում է 50 μM Cy3-azide (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4) և 0.5 մգ/մլ նատրիումի ասկորբատ (Aladdin, No. S105024) և 30 րոպե ինկուբացնել սենյակային ջերմաստիճանում:Կտրուկ ռեակցիայից հետո բջիջները վեց անգամ լվացվել են PBS-ով, որը պարունակում է 0,05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) և այնուհետև արգելափակվել 5% BSA-ով (Abcone, #B24726) PBST-ով 30 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում:
Կոլոկալիզացիոն իմունագոյացման համար բջիջները ինկուբացվել են առաջնային հակամարմիններով՝ ըստ նշված պայմանների. նապաստակի պոլիկլոնալ հակակալնեքսինային հակամարմին (1:500, Abcam, #ab22595) կամ նապաստակի հակալամինային A/C մոնոկլոնալ հակամարմին (1:500; CST, #2032) 4 °C գիշերում:PBST-ով 3 անգամ լվանալուց հետո բջիջները ինկուբացվել են երկրորդական հակամարմիններով՝ այծի հակաճագարային Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) նոսրացված 1:1000, այծի հակամկնիկի Alexa Fluor 594 (CST, #8889) նոսրացված 1:10:նոսրացում 30 րոպե նոսրացնել սենյակային ջերմաստիճանում:Այնուհետև բջիջները 3 անգամ լվացվեցին PBST-ով և DAPI-ով (Թերմո, #D1306) ներկվեցին PBS-ում 10 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում:PBS-ով 3 լվացումից հետո բջիջները փակվեցին 50% գլիցերինով (Sangon, #A600232) PBS-ում պատկերման համար:Իմունֆլյուորեսցենտ պատկերներ են ստացվել ZEISS LSM 900 Airyscan2 կոնֆոկալ մանրադիտակի և ZNE 3.5 ծրագրաշարի միջոցով:
Միանգամյա թթվածնային լյումինեսցենտային պատկերման համար բջիջները երկու անգամ լվացվել են Hanks HEPES բուֆերով՝ նախքան Hanks HEPES բուֆերում 100 nM Si-DMA ավելացնելը (DOJINDO, #MT05):Լույսի ազդեցությունից հետո բջիջները ինկուբացվել են CO2 ինկուբատորում 37°C ջերմաստիճանում 45 րոպե:Այնուհետև բջիջները երկու անգամ լվացվեցին Hanks-ի HEPES բուֆերով և հականերկվեցին Hoechst-ով Hanks-ի HEPES բուֆերում 10 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում և տեսանելի դարձան ZEISS LSM 900 կոնֆոկալ մանրադիտակի միջոցով:, #M36008) կալցիում և մագնեզիում պարունակող HBSS բուֆերում։Լույսի կամ դոքսորուբիցինի (MCE, #HY-15142A) ազդեցությունից հետո բջիջները ինկուբացվել են CO2 ինկուբատորում 37°C-ում 10 րոպե, երկու անգամ լվացվել HBSS բուֆերով և ինկուբացվել Hoechst-ով HBSS բուֆերում սենյակային ջերմաստիճանում:րոպե.Դոքսորուբիցինը օգտագործվել է որպես դրական զոնդային հսկողություն, որտեղ բջիջները մշակվել են 20 μM դոքսորուբիցինով HBSS-ում, որը պարունակում է 1% BSA 30 րոպե:Իմունֆլյուորեսցենտային պատկերներ են ստացվել Zeiss LSM 900 կոնֆոկալ մանրադիտակի միջոցով:
HEK293T բջիջները, որոնք կայունորեն արտահայտում են mito-miniSOG, սերմնացան մոտավորապես 30% խտությամբ 15 սմ երկարությամբ ափսեներում:48 ժամից հետո, երբ հասավ ~80% միաձուլման, բջիջները մեկ անգամ լվացվեցին PBS-ով, ինկուբացվեցին 1 մՄ զոնդ 3-ով թարմ HBSS բուֆերում 1 ժամ 37°C-ում և այնուհետև 10 րոպե լուսավորվեցին սենյակում կապույտ LED-ով: ջերմաստիճանը..Այնուհետև բջիջները երկու անգամ լվացվեցին PBS-ով, քերեցին և նորից կասեցվեցին սառցե PBS բուֆերում, որը պարունակում է EDTA-ազատ պրոթեզերոնի ինհիբիտորներ (MCE, #HY-K0011):Բջիջները լիզվում են 1 րոպեի ընթացքում ծայրի արտանետման միջոցով (1 վայրկյան միացված և 1 վայրկյան անջատում 35% ամպլիտուդով):Ստացված խառնուրդը ցենտրիֆուգվել է 15,871 xg-ում 10 րոպե 4°C-ում՝ բեկորները հեռացնելու համար, և վերին նյութի կոնցենտրացիան ճշգրտվել է մինչև 4 մգ/մլ՝ օգտագործելով BCA սպիտակուցի փորձարկման հավաքածու (Beyotime, #P0009):1 մլ վերը նշված լիզատը միացրեք 0,1 մՄ ֆոտոքայքայվող բիոտին ազիդին (Confluore, #BBBD-14), 1 մՄ TCEP (Sangon, #A600974), 0,1 մՄ TBTA լիգանդին (Aladdin, #T162437) և 1 մՄ SO4 ինկուբատորով: ռոտացիան մինչև 1 ժամ սենյակային ջերմաստիճանում:Կտրուկ ռեակցիայից հետո խառնուրդը ավելացրեք նախապես խառնված լուծույթին (MeOH:CHCl3:H2O = 4 մլ:1 մլ:3 մլ) 10 մլ ապակե սրվակի մեջ:Նմուշները խառնվել են և ցենտրիֆուգվել 4500 գ-ում 10 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում:Ներքևի և վերին լուծույթները դեն նետվեցին, նստվածքը երկու անգամ լվացվեց 1 մլ մեթանոլով և ցենտրիֆուգվեց 15871×g 5 րոպե 4°C-ում:Ավելացրեք 1 մլ 8 Մ միզանյութ (Aladdin, No. U111902) 25 մմ ամոնիումի բիկարբոնատում (ABC, Aladdin, No. A110539) նստվածքը լուծարելու համար:Նմուշները վերականգնվել են 10 մՄ դիթիոթրեիտոլով (Sangon, #A100281 25 մՄ ABC-ում) 40 րոպե 55°C-ում, որին հաջորդել է 15 մՄ թարմ յոդոացետամիդ (Sangon, #A600539) ավելացում սենյակային ջերմաստիճանում մթության մեջ:Ալկիլացում 30 րոպեի ընթացքում:.Ռեակցիան դադարեցնելու համար ավելացվել է լրացուցիչ 5 մՄ դիթիոթրեիտոլ:Յուրաքանչյուր նմուշի համար պատրաստեք մոտավորապես 100 µl NeutrAvidin ագարոզայի հատիկներ (Thermo, #29202)՝ 3 անգամ լվանալով 1 մլ PBS-ով:Վերոնշյալ պրոտեոմի լուծույթը նոսրացրել են 5 մլ PBS-ով և ինկուբացրել են նախապես լվացված NeutrAvidin ագարոզայի ուլունքներով 4 ժամ սենյակային ջերմաստիճանում:Այնուհետև ուլունքները լվացվել են 3 անգամ 5 մլ PBS-ով, որը պարունակում է 0,2% SDS (Sangon, #A600485), 3 անգամ 5 մլ PBS-ով, որը պարունակում է 1M urea, և 3 անգամ 5 մլ ddH2O-ով:Այնուհետև հատիկները հավաքվել են ցենտրիֆուգման միջոցով և նորից կասեցվել 200 մկլ 25 մՄ ABC-ում, որը պարունակում է 1 մ միզանյութ, 1 մՄ CaCl 2 (Macklin, #C805228) և 20 նգ/մլ տրիպսին (Promega, #V5280):Տրիպսինացնել մեկ գիշերվա ընթացքում 37°C ջերմաստիճանում պտույտով:Արձագանքը դադարեցվել է մրջնաթթու (Թերմո, # A117-50) ավելացնելով, մինչև pH-ը հասնի 2-3:Բշտիկները 3 անգամ լվացվել են 0,2% SDS պարունակող 1 մլ PBS-ով, 3 անգամ 1 մլ միզանյութ պարունակող 1 մլ PBS-ով, ապա 3 անգամ 1 մլ թորած ջրով:Փոփոխված պեպտիդներն ազատվել են լույսի լուծմամբ (365 նմ) 90 րոպեի ընթացքում՝ օգտագործելով 200 մկլ 70% MeOH:Ցենտրիֆուգումից հետո վերին նյութը հավաքվել է:Այնուհետև ուլունքները մեկ անգամ լվանում են 100 մկլ 70% MeOH-ով, և ավելորդ նյութերը հավաքվում են:Նմուշները չորացվել են Speedvac վակուումային կոնցենտրատորում և պահել -20°C-ում մինչև վերլուծությունը:
Թթվածնի ձևափոխված պեպտիդները նույնականացնելու և քանակականացնելու համար նմուշները նորից լուծվեցին 0,1% մրջնաթթվի մեջ և 1 մկգ պեպտիդները վերլուծվեցին Orbitrap Fusion Lumos Tribrid զանգվածային սպեկտրոմետրի միջոցով, որը հագեցած է Tune-ից նանո ESI աղբյուրով և Xcalibur-ից վաճառող ծրագրաշարից 4.3:Նմուշներն առանձնացվել են 75 մկմ × 15 սմ ներսից փաթեթավորված մազանոթային սյունակի վրա 3 մկմ C18 նյութով (ReproSil-pur, #r13.b9.) և միացվել են EASY-nLC 1200 UHPLC համակարգին (Thermo):Պեպտիդներն առանձնացվել են գծային 95 րոպե գրադիենտ քրոմատագրմամբ՝ 8% լուծիչ B-ից մինչև 50% լուծիչ B (A = 0,1% մածուցիկ թթու ջրի մեջ, B = 0,1% մածուցիկ թթու 80% ացետոնիտրիլում), այնուհետև գծայինորեն ավելացվել է մինչև 98% B րոպե։ 6 րոպեում 300 նլ/րոպե հոսքի արագությամբ:Orbitrap Fusion Lumos-ը տվյալներ է հավաքում հերթափոխով՝ ամբողջական MS սկանավորման և MS2 սկանավորման միջև՝ կախված տվյալներից:Թափման լարումը սահմանվել է 2,1 կՎ, իսկ իոնային փոխադրող մազանոթի ջերմաստիճանը եղել է 320°C:MS սպեկտրները (350-2000 մ/ց) հավաքվել են 120,000 թույլատրությամբ, AGC 4 × 105 և առավելագույն մուտքային ժամանակ՝ 150 ms:10 ամենատարածված բազմակի լիցքավորված պրեկուրսորները յուրաքանչյուր ամբողջական սկանավորման ժամանակ մասնատվել են HCD-ի միջոցով՝ բախման նորմալացված էներգիայով 30%, քառաբևեռ մեկուսացման պատուհանով 1,6 մ/ց և լուծաչափով 30000:AGC թիրախ տանդեմ զանգվածային սպեկտրոմետրիայի համար՝ օգտագործելով 5×104 և առավելագույն մուտքային ժամանակը 150 ms:Դինամիկ բացառությունը սահմանվել է 30 վայրկյան: Չսահմանված իոնները կամ 1+ և >7+ լիցք ունեցող իոնները մերժվել են MS/MS-ի համար: Չսահմանված իոնները կամ 1+ և >7+ լիցք ունեցող իոնները մերժվել են MS/MS-ի համար: Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Չսահմանված իոնները կամ 1+ և >7+ լիցք ունեցող իոնները մերժվել են MS/MS-ի համար:未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Չճշտված իոնները կամ 1+ և >7+ լիցքերով իոնները մերժվել են MS/MS-ի համար:
Հում տվյալները մշակվում են FragPipe հաշվողական հարթակի միջոցով՝ հիմնված MSFragger-ի վրա:Զանգվածի կողմնակալությունը և համապատասխան ամինաթթուները որոշվել են՝ օգտագործելով բաց որոնման ալգորիթմ՝ -150-ից մինչև 500 Da պրեկուրսորի զանգվածի հանդուրժողականությամբ:Փոփոխված պեպտիդներն այնուհետև հայտնաբերվեցին՝ օգտագործելով հիստիդինային փոփոխություններ՝ +229,0964 և +247,1069 Da զանգվածային ավելացումներով PD-ում (Proteome Discoverer 2.5, Thermo):
Միաձուլված miniSOG գենը կայուն արտահայտող բջիջները տեղադրվել են 6 սմ երկարությամբ սպասքի մեջ:Հասնելով ~80% միախառնման՝ բջիջները մեկ անգամ լվացվել են HBSS-ով (Gibco, #14025092), այնուհետև ինկուբացվել են քիմիական զոնդերով HBSS-ում 1 ժամ 37°C-ում և լուսավորվել կապույտ լույսով:10W LED 20 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում:Որոշելու համար, թե որ տեսակի ռեակտիվ թթվածնի տեսակներն են ներգրավված PDPL-ում, 0,5 մՄ վիտամին C (MCE, #HY-B0166), 5 մՄ Տրոլոքս (MCE, #HY-101445), D2O (Սիգմա, #7789-20-0), Որպես հավելումներ բջիջներին ավելացվել են 100 մՄ մանիտոլ (Energy Chemical, #69-65-8), 100 μM H2O2, 10 մՄ NaN3:Սառը PBS-ով լվանալուց հետո բջիջները քերվել են, հավաքվել 1,5 մլ ցենտրիֆուգային խողովակներում և 1 րոպե 200 մկլ PBS-ի մեջ 1 րոպե քսել են ցենտրիֆուգային խողովակներում 1x պրոթեզերոնի ինհիբիտորով (1 վրկ և 1 վրկ առանց ամպլիտուդիա 35%):Ստացված խառնուրդը ցենտրիֆուգվել է 15,871 × գ 10 րոպե 4 °C-ում, և վերին նյութի կոնցենտրացիան ճշգրտվել է մինչև 1 մգ/մլ՝ օգտագործելով BCA սպիտակուցի վերլուծության հավաքածու:Մոտավորապես 50 մկլ վերը նշված լիզատը ինկուբացվել է 0,1 մՄ ռոդամին ազիդով (Aladdin, No. T131368), 1 մՄ TCEP, 0,1 մՄ TBTA լիգանդի և 1 մՄ CuSO4 1 ժամվա ընթացքում սենյակային ջերմաստիճանում ներքևից վերև պտույտով:Սեղմման ռեակցիայից հետո ացետոնով նստեցումը կատարվել է՝ նմուշներին ավելացնելով 250 մկլ նախապես սառեցված ացետոն, ինկուբացնելով -20°C-ում 20 րոպե և ցենտրիֆուգելով 6010×g-ում 10 րոպե 4°C-ում:Հավաքեք գնդիկը և եփեք 50 մկլ 1x Laemmli's բուֆերի մեջ 10 րոպե 95 °C ջերմաստիճանում:Նմուշներն այնուհետև վերլուծվել են SDS-PAGE երկար գելերի վրա և պատկերացվել՝ օգտագործելով Bio-rad ChemiDoc MP Touch պատկերային համակարգը Image Lab Touch ծրագրաշարով:
Ռեկոմբինանտ miniSOG-6xHis սպիտակուցի արտահայտումը և մաքրումը կատարվել է ինչպես նախկինում նկարագրված:Համառոտ, E. coli BL21(DE3) բջիջները (TransGen, #CD701-02) փոխակերպվել են pET21a-miniSOG-6xHis-ով, իսկ սպիտակուցի էքսպրեսիան առաջացել է 0.5 մՄ IPTG-ով (Sangon, #A600168):Բջիջների լիզից հետո սպիտակուցները մաքրվել են Ni-NTA ագարոզայի ուլունքների միջոցով (MCE, No. 70666), դիալիզացվել են PBS-ի դեմ և պահվել –80°C-ում:
Հակամարմինների վրա հիմնված in vitro պիտակի հարևանության հետազոտության համար խառնեք 100 μM մաքրված miniSOG, 1 մՄ զոնդ 3 և 1 մկգ հակապիտակավորված մկնիկի մոնոկլոնալ հակամարմին (TransGen, #HT501-01) PBS-ում մինչև 50 մկլ ռեակցիայի ընդհանուր ծավալը:.Ռեակցիոն խառնուրդը 0, 2, 5, 10 և 20 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում ճառագայթվել է կապույտ LED լույսով:Խառնուրդը ինկուբացվել է 0,1 մՄ բիոտին-PEG3-ազիդով (Aladdin, #B122225), 1 մՄ TCEP, 0,1 մՄ TBTA լիգանդով և 1 մՄ CuSO4-ով 1 ժամ սենյակային ջերմաստիճանում դեպի վեր շարժվող ցնցող սարքի վրա:Հապճեպ ռեակցիայից հետո 4x Laemmli's բուֆեր ավելացնել անմիջապես խառնուրդին և եռացնել 95°C-ում 10 րոպե:Նմուշները վերլուծվել են SDS-PAGE գելերի վրա և վերլուծվել են western blotting-ով streptavidin-HRP-ով (1:1000, Solarbio, #SE068):
Հիստիդին պարունակող սինթետիկ պեպտիդ C-տերմինալ ամիդայով (LHDALDAK-CONH2) օգտագործվել է մոտակա պեպտիդների վրա հիմնված in vitro պիտակավորումը վերլուծելու համար:Այս վերլուծության մեջ 100 մկմ մաքրված miniSOG, 10 մՄ զոնդ 3 և 2 մկգ/մլ սինթետիկ պեպտիդ խառնվել են PBS-ում՝ 50 մկլ ընդհանուր ռեակցիայի ծավալով:Ռեակցիոն խառնուրդը 1 ժամվա ընթացքում սենյակային ջերմաստիճանում ճառագայթվել է կապույտ LED լույսով:Մեկ միկրոլիտր նմուշը վերլուծվել է LC-MS համակարգի միջոցով (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight զանգվածային սպեկտրոմետր MassLynx սպեկտրի վերլուծության ծրագրաշարով):
HEK293T բջիջները, որոնք կայուն կերպով արտահայտում են miniSOG միաձուլման գենը, ցանվել են 10 սմ երկարությամբ ափսեներում՝ տարբեր օրգանելների տեղայնացում ունեցող գծերի համար (Mito, ER, Nucleus) և 15 սմ ափսեներում՝ Parkin-miniSOG և BRD4-miniSOG գծերի համար:Հասնելով ~90% միախառնման՝ բջիջները մեկ անգամ լվացվեցին HBSS-ով, այնուհետև ինկուբացվեցին 3-րդ զոնդով HBSS-ում 1 ժամ 37°C-ում և լուսավորվեցին 10 Վտ կապույտ LED-ով սենյակային ջերմաստիճանում:Պարկինի ոչ կոնտակտային պիտակավորման համար 10 μM պրոտոն կարբոնիլ ցիանիդ կրող m-քլորոֆենիլհիդրազոն CCCP (Solarbio, #C6700) 3-ի հետ HBSS-ում ավելացվել է 1 ժամ 37°C ջերմաստիճանում:Բջիջների լիզման, սեղմման քիմիայի, ռեդուկցիայի և ալկիլացման քայլերը նույնն էին, ինչ նկարագրված է վերևում, բացառությամբ, որ 2 մգ լիզատ է ավելացվել և բիոտինի PEG3 ազիդը օգտագործվել է սեղմման ռեակցիայում՝ ֆոտոքայքայվող բիոտին ազիդի փոխարեն:Հարստացումից հետո ուլունքները 3 անգամ լվացվել են 0,2% SDS պարունակող 5 մլ PBS-ով, 3 անգամ 1 մ միզանյութ պարունակող 5 մլ PBS-ով և 3 անգամ 5 մլ PBS-ով:Այնուհետև, 2 մկգ տրիպսին ավելացվեց 300 մկլ 25 մՄ ABC-ին, որը պարունակում էր 1 մ միզանյութ՝ սպիտակուցը 37°C-ում գիշերը կտրելու համար:Արձագանքը դադարեցվել է մաթնաթթվի ավելացմամբ մինչև pH-ի հասնելը 2-3:Բշտիկների վրա տրիպսինացումից հետո պեպտիդային լուծույթը աղազերծվել է SOLAµ HRP սյունակի միջոցով (Thermo, #60209-001) և չորացվել է Speedvac վակուումային խտացուցիչում:Պեպտիդները կրկին լուծվել են 0,1% մրջնաթթվի մեջ և 500 նգ պեպտիդները վերլուծվել են Orbitrap Fusion Lumos Tribrid զանգվածային սպեկտրոմետրի միջոցով, որը հագեցած է վերը նկարագրված նանո-ESI աղբյուրով:Պեպտիդներն առանձնացվել են առևտրային RP-HPLC նախասյուների վրա (75 մկմ x 2 սմ) (Թերմո, թիվ 164946) և վերլուծական RP-HPLC սյունակներում (75 մկմ x 25 սմ) (Թերմո, թիվ 164941), երկուսն էլ լցված 2 մկմ:գրադիենտ 8%-ից մինչև 35% ACN 60 րոպեի ընթացքում, այնուհետև 6 րոպեում գծային կերպով ավելացել է մինչև 98% B՝ 300 Նլ/րոպե հոսքի արագությամբ:MS սպեկտրները (350-1500 մ/ց) հավաքվել են 60000 թույլատրությամբ, AGC 4 × 105 և առավելագույն մուտքային ժամանակ՝ 50 ms:Ընտրված իոնները հաջորդաբար մասնատվել են HCD-ով 3 վ ցիկլերի ընթացքում բախման նորմալացված էներգիայով 30%, քառաբևեռ մեկուսացման պատուհանով 1,6 մ/ց և թույլատրելիությամբ 15000: 5 × 104 տանդեմ զանգվածային սպեկտրոմետր AGC թիրախ և առավելագույն ներարկման ժամանակ: օգտագործվել է 22 ms.Դինամիկ բացառումը սահմանվել է 45 վայրկյան: Չսահմանված իոնները կամ 1+ և >7+ լիցք ունեցող իոնները մերժվել են MS/MS-ի համար: Չսահմանված իոնները կամ 1+ և >7+ լիցք ունեցող իոնները մերժվել են MS/MS-ի համար: Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Չսահմանված իոնները կամ 1+ և >7+ լիցք ունեցող իոնները մերժվել են MS/MS-ի համար:未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Չճշտված իոնները կամ 1+ և >7+ լիցքերով իոնները մերժվել են MS/MS-ի համար:
Նմուշի պատրաստման քայլերը մինչև NeutrAvidin ուլունքների հարստացումը նույնն էին, ինչ վերը նկարագրված LC-MS/MS վերլուծության մեջ:Մոտ 50 մկգ լիզատ օգտագործվել է որպես մուտքային բեռնման հսկողության համար, իսկ 2 մգ լիզատ՝ սեղմելով ռեակցիաների համար:Նեյտրավիդինով հարստացնելուց և լվանալուց հետո կապակցված սպիտակուցները ողողվել են՝ ավելացնելով 50 մկլ Laemmli-ի բուֆեր ագարոզայի խեժի ուլունքներին և եռացնելով 95°C-ում 5 րոպե:Վերահսկիչ բեռի մուտքագրման և բշտիկներով հարստացված նմուշները վերլուծվել են SDS-PAGE-ով և փոխանցվել են PVDF թաղանթներին (Millipore, #ISEQ00010) ստանդարտ Western blot մեթոդներով:Թաղանթները արգելափակվել են 5% յուղազերծված կաթով (Sangon, #A600669) TBS-ում, որը պարունակում է 0.1% tween-20 (TBST) և հաջորդաբար ինկուբացվել առաջնային և երկրորդային հակամարմիններով:Առաջնային հակամարմինները նոսրացվել են 1:1000 հարաբերակցությամբ 5% յուղազերծված կաթում TBST-ում և ինկուբացվել գիշերը 4°C-ում:Երկրորդական հակամարմինները օգտագործվել են 1:5000 հարաբերակցությամբ և 1 ժամ ինկուբացվել սենյակային ջերմաստիճանում:Թաղանթները տեսանելի են եղել քիմիլյումինեսցենցիայի միջոցով՝ օգտագործելով Chemidoc MP պատկերային համակարգը:Նկարում բլոտների և գելերի բոլոր չկտրված սքաները ներկայացված են որպես չմշակված տվյալներ:
Այս հետազոտության մեջ օգտագործված առաջնային հակամարմինները ներառում էին նապաստակի հակա-SFPQ մոնոկլոնալ հակամարմին (CST, թիվ 71992), նապաստակի հակա-FUS մոնոկլոնալ հակամարմին (CST, թիվ 67840), նապաստակի հակա-NSUN2 պոլիկլոնալ հակամարմին (Proteintech, No. 20854-1-): AP), նապաստակի հակա-mSin3A պոլիկլոնալ հակամարմին (Abcam, #ab3479), մկնիկի հակապիտակավորման մոնոկլոնալ հակամարմին (TransGen, #HT201-02), մկնիկի հակա-β-ակտին մոնոկլոնալ հակամարմին (TransGen, #HC201-01), նապաստակի հակամարմին: -CDK2 մոնոկլոնալ հակամարմին (ABclonal, #A0094), նապաստակի մոնոկլոնալ հակամարմին CTBP1-ին (ABclonal, #A11600), նապաստակի պոլիկլոնալ հակամարմին DUT-ին (ABclonal, #A2901), նապաստակի պոլիկլոնալ հակամարմին PSMC4-ին (ABclonal, #A2505), DNAJB1 պոլիկլոնալ հակամարմին (ABclonal, # A5504):Այս հակամարմինները օգտագործվել են 1:1000 նոսրացումով 5% յուղազրկված կաթում TBST-ում:Այս հետազոտության մեջ օգտագործված երկրորդային հակամարմինները ներառում էին հակաճագարային IgG (TransGen, #HS101-01), հակամկան IgG (TransGen, #HS201-01) 1:5000 նոսրացումով:
Հետագա ուսումնասիրելու համար, թե արդյոք BRD4-ը փոխազդում է SFPQ-ի հետ, կայուն HEK293T և BRD4-miniSOG բջիջները, որոնք գերարտահայտում են HEK293T, տեղադրվեցին 10 սմ երկարությամբ սպասքի մեջ:Բջիջները լվացվեցին սառը PBS-ով և լուծվեցին 1 մլ Pierce IP լիզի բուֆերի մեջ (Thermo Fisher, #87787) EDTA-ազատ պրոթեզերոնի արգելակիչով 30 րոպե 4°C-ում:Դրանից հետո լիզատները հավաքվել են 1,5 մլ ցենտրիֆուգային խողովակներում և ցենտրիֆուգվել 15871 xg 10 րոպե 4°C-ում:Վերևը հավաքվել և ինկուբացվել է 5 մկգ հակա-V5 պիտակավորված մկան մոնոկլոնալ հակամարմինով (CST, #80076) մեկ գիշերվա ընթացքում 4°C-ում:Լվացեք մոտավորապես 50 μl սպիտակուց A/G մագնիսական ուլունքներ (MCE, #HY-K0202) երկու անգամ PBS-ով, որը պարունակում է 0,5% Tween-20:Այնուհետև բջիջների լիզատները 4 ժամ ինկուբացվել են մագնիսական ուլունքներով 4°C ջերմաստիճանում` ներքևից վերև պտույտով:Այնուհետև հատիկները չորս անգամ լվացվեցին 1 մլ PBST բուֆերով և եփեցին 95°C-ում 5 րոպե:Նմուշները վերլուծվել են SDS-PAGE գելերի վրա և փոխանցվել են PVDF մեմբրանների վրա՝ օգտագործելով ստանդարտ Western blot մեթոդները:Թաղանթները արգելափակվել են 5% յուղազերծված կաթում TBST-ում և հաջորդաբար ինկուբացվել են առաջնային և երկրորդային հակամարմիններով:Առաջնային հակամարմին Rabbit anti-SFPQ մոնոկլոնալ հակամարմինը (CST, #71992) օգտագործվել է 1:1000 հարաբերակցությամբ 5% յուղազրկված կաթում TBST-ում և ինկուբացվել է գիշերը 4°C-ում:Նապաստակի դեմ IgG-ն օգտագործվել է 1:5000 հարաբերակցությամբ և 1 ժամ ինկուբացվել սենյակային ջերմաստիճանում:Թաղանթները տեսանելի են եղել քիմիլյումինեսցենցիայի միջոցով՝ օգտագործելով Chemidoc MP պատկերային համակարգը:
Բոլոր կառուցվածքները, որոնք օգտագործվում են Լուծիչների հասանելի մակերեսի (SASA) վերլուծության համար, ստացվել են Protein Data Bank (PDB)52 կամ AlphaFold Protein Structure Database-ից53:Բացարձակ SASA-ն հաշվարկվել է յուրաքանչյուր մնացորդի համար՝ օգտագործելով FreeSASA ծրագիրը:Միայն ամբողջական և միանշանակ SASA տվյալները պիտակավորված հիստիդինի և նրա հարևանների համար օգտագործվել են յուրաքանչյուր կառուցվածքի համար միջին SASA ստանալու համար:Հարաբերական լուծիչների հասանելիությունը (RSA) յուրաքանչյուր հիստիդինի համար հաշվարկվել է SASA-ի բացարձակ արժեքը բաժանելով լուծիչին հասանելի մնացորդային մակերեսի էմպիրիկ առավելագույն հնարավոր մակերեսի վրա:Այնուհետև բոլոր հիստիդինները դասակարգվեցին որպես թաքնված, եթե միջին RSA-ն 20%-ից ցածր էր, հակառակ դեպքում՝ բացահայտված56:
DDA ռեժիմում ձեռք բերված չմշակված ֆայլերը որոնվել են Proteome Discoverer-ի (v2.5) կամ MSfragger-ի (Fragpipe v15.0) միջոցով SwissProt-ի ստուգված սպիտակուցային տվյալների բազայում, որը պարունակում է ընդհանուր աղտոտիչներ:Պեպտիդները պահանջում էին ամբողջական տրիպսին՝ երկու բացակայող ճեղքման վայրերով՝ կարբամոյլ մեթիլացում՝ որպես ֆիքսված փոփոխություն և մեթիոնինի օքսիդացում՝ որպես դինամիկ ձևափոխում։Նախածանցի և հատվածի քաշի հանդուրժողականությունը սահմանվել է համապատասխանաբար 10 ppm և 0.02 Da (MS2 Orbitrap): Աղտոտիչները հեռացվեցին, և սպիտակուցները զտվեցին՝ <1% կեղծ հայտնաբերման գործակից ստանալու համար: Աղտոտիչները հեռացվեցին, և սպիտակուցները զտվեցին՝ <1% կեղծ հայտնաբերման գործակից ստանալու համար: Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы получить коэффициент ложного обнаружения <1%. Աղտոտող նյութերի հարվածները հեռացվել են և սպիտակուցները ֆիլտրվել են՝ ապահովելով <1% կեղծ հայտնաբերման արագություն:去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率。 Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы для достижения уровня ложных обнаружений <1%. Աղտոտիչները հեռացվեցին և սպիտակուցները զտվեցին՝ հասնելու համար <1% կեղծ դրական ցուցանիշի:Քանակական վերլուծության համար առանց պիտակների օգտագործման, օգտագործվել է երեք կենսաբանական կրկնություններից նորմալացված սպիտակուցի պարունակությունը:Սպիտակուցի ենթաբջջային տեղայնացման վերլուծությունն իրականացվել է DAVID Bioinformatics Resources-ի, MitoCarta 3.0-ի Gene Ontology (GO) վերլուծության և Alice Ting խմբի կողմից կազմված և հրապարակված տվյալների բազաների միջոցով:Հրաբխի քարտեզը ստացվել է Պերսեուսից (v1.6.15.0): Սպիտակուցների առատության ծալովի փոփոխությունները փորձարկվել են վիճակագրական նշանակության համար՝ օգտագործելով երկկողմանի t-թեստ, և սպիտակուցի հարվածները նույնացվել են առատության փոփոխությամբ >2 (եթե այլ բան նշված չէ) և p արժեքը <0,05: Սպիտակուցների առատության ծալովի փոփոխությունները փորձարկվել են վիճակագրական նշանակության համար՝ օգտագործելով երկկողմանի t-թեստ, և սպիտակուցի հարվածները նույնացվել են առատության փոփոխությամբ >2 (եթե այլ բան նշված չէ) և p արժեքը <0,05: Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы изменением содержания> 2 (если не е значение) Սպիտակուցի բովանդակության ծալովի փոփոխությունները փորձարկվել են վիճակագրական նշանակության համար՝ օգտագործելով երկկողմանի t-թեստ, և սպիտակուցի համընկնումները նույնականացվել են բովանդակության փոփոխությամբ >2 (եթե այլ բան նշված չէ) և ap արժեքով <0,05:使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 丰度 倍数 的 统计 统计 统计 统计 统计 统计 显着性 的 丰度 变化 变化> 2 (除非 另 有 说明) 和 p 值 <0.05:使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 倍 数 变化 的 统计 显着性 显着性 并 蛋白质 蛋白质 中 的 丰度 变化> 2 (另 有 说明) 和 p 值 <0.05: Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иноей <0, и. Սպիտակուցի պարունակության ծալովի փոփոխությունների վիճակագրական նշանակությունը փորձարկվել է երկակի t-թեստի միջոցով, և սպիտակուցի համընկնումները որոշվել են բովանդակության փոփոխության համար >2 (եթե այլ բան նշված չէ) և p-արժեքները <0,05:Սպիտակուցների փոխազդեցության վերլուծությունը կատարվել է GO վերլուծության միջոցով String տվյալների բազայի հետ միասին:
Նմանատիպ արդյունքներով իրականացվել են երեք կենսաբանական կրկնօրինակումներ:Վիճակագրական վերլուծությունը կատարվել է GraphPad Prism-ով (GraphPad ծրագրային ապահովում) և հրաբխի սյուժեները ստեղծվել են Perseus-ով (v1.6.15.0):Երկու խմբերը համեմատելու համար p-արժեքները որոշվել են՝ օգտագործելով երկկողմանի ուսանողական t-թեստ:Փորձարարական խմբում առնվազն երկու անգամ հայտնաբերված միայն միանգամյա սպիտակուցները ներառվել են հրաբխի սյուժեներում, իսկ վերահսկիչ խմբում համապատասխան բացակայող արժեքները փոխարինվել են Պերսեուսով նորմալ բաշխումից, որպեսզի հնարավոր լինի հաշվարկել p-արժեքը:Սխալների գծերը ներկայացնում են միջին ± ստանդարտ շեղումը:Վիճակագրական վերլուծության համար պրոտեոմիկ անալիզներում պահպանվել է սպիտակուցների առատությունը, որոնք հայտնվել են առնվազն երկու կենսաբանական կրկնօրինակներով:Ընտրանքի չափը նախապես որոշելու համար վիճակագրական մեթոդներ չեն օգտագործվել:Փորձերը պատահական չեն։Փորձի և արդյունքների գնահատման ընթացքում հետազոտողները կույր չեն եղել առաջադրանքների նկատմամբ։
Ուսումնասիրության նախագծման մասին լրացուցիչ տեղեկությունների համար տե՛ս «Nature Research Report»-ի համառոտագիրը՝ կապված այս հոդվածի հետ:
Այս ուսումնասիրության արդյունքում ստացված զանգվածային սպեկտրոմետրիայի տվյալները ներկայացվել են ProteomeXchange կոնսորցիումին iProX57 գործընկեր պահոցի միջոցով՝ տվյալների բազայի ID PXD034811 (PDPL-MS տվյալների բազա) ներքո:Հում տվյալները տրամադրվում են չմշակված տվյալների ֆայլերի տեսքով:Այս հոդվածը տրամադրում է բնօրինակ տվյալները:
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Ծանոթանալ հարևանությանը. օգտագործել հարևանությունից կախված բիոտինիլացում՝ սպիտակուցային համալիրները բնութագրելու և օրգանելները քարտեզագրելու համար: Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Ծանոթանալ հարևանությանը. օգտագործել հարևանությունից կախված բիոտինիլացում՝ սպիտակուցային համալիրները բնութագրելու և օրգանելները քարտեզագրելու համար:Gingras, AS, Abe, KT and Raut, B. Ծանոթություն շրջակա միջավայրին. օգտագործելով հարևանությունից կախված բիոտինիլացումը՝ բնութագրելու սպիտակուցային համալիրները և քարտեզագրելու օրգանելները: Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. 了解邻里：使用邻近依赖性生物素化来表征蛋白质复合物解复合物徶并 Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Հասկանալով հարևանությունը. օգտագործեք թաղամասի կախվածությունը կենսաբանական կյանքից:Gingras, AS, Abe, KT and Raut, B. Հասկանալով հարևանությունը. սպիտակուցային բարդույթների բնութագրում և օրգանելների քարտեզագրում՝ օգտագործելով մոտիկությունից կախված բիոտինիլացում:Ընթացիկ.Իմ կարծիքը.Քիմիական.կենսաբանություն 48, 44–54 (2019):
Geri, JB et al.Միկրոմիջավայրի քարտեզագրում՝ Dexter էներգիան իմունային բջիջներին փոխանցելով:Science 367, 1091–1097 (2020):
Hertling, EL et al.Երկու պրոտեոմի մասշտաբով ցանցերը հայտնաբերում են մարդու փոխազդեցության բջիջների հատուկ վերափոխումը:Բջիջներ 184, 3022–3040.e3028 (2021):