Նորություններ

Շնորհակալություն Nature.com այցելելու համար:Ձեր օգտագործած բրաուզերի տարբերակը ունի սահմանափակ CSS աջակցություն:Լավագույն փորձի համար խորհուրդ ենք տալիս օգտագործել թարմացված դիտարկիչ (կամ անջատել Համատեղելիության ռեժիմը Internet Explorer-ում):Միևնույն ժամանակ, շարունակական աջակցությունն ապահովելու համար մենք կայքը կներկայացնենք առանց ոճերի և JavaScript-ի:
Քաղցկեղի բջիջները մշակել են տարբեր մեխանիզմներ՝ բջջային սթրեսը հաղթահարելու և առաջընթացը շարունակելու համար:Protein kinase R (PKR) և դրա սպիտակուցային ակտիվացնողը (PACT) նախնական արձագանքողներն են, որոնք վերահսկում են տարբեր սթրեսային ազդանշանները, որոնք հանգեցնում են բջիջների տարածման և ապոպտոզի արգելակմանը:Այնուամենայնիվ, քաղցկեղի բջիջներում PACT-PKR ճանապարհի կարգավորումը հիմնականում անհայտ է մնում:Այստեղ մենք պարզեցինք, որ երկարատև ոչ կոդավորող ՌՆԹ (lncRNA) ասպարտիլ tRNA սինթետազ հակասիտ ՌՆԹ 1 (DARS-AS1) ուղղակիորեն ներգրավված է PACT-PKR ճանապարհի արգելակման մեջ և նպաստում է քաղցկեղի բջիջների տարածմանը:Օգտագործելով CRISPRi 971 քաղցկեղի հետ կապված lncRNA-ի լայնածավալ ֆունկցիոնալ զննում, մենք պարզեցինք, որ DARS-AS1-ը կապված է զգալիորեն ուժեղացված քաղցկեղային բջիջների տարածման հետ:Հետևաբար, DARS-AS1 նոկաուտը արգելակում է բջիջների բազմացումը և խթանում քաղցկեղային բջիջների ապոպտոզիան տարբեր քաղցկեղային բջիջների գծերում in vitro և զգալիորեն նվազեցնում է ուռուցքի աճը in vivo-ում:Մեխանիկորեն DARS-AS1-ը ուղղակիորեն կապվում է PACT ակտիվացման տիրույթին և կանխում PACT-PKR փոխազդեցությունը՝ դրանով իսկ նվազեցնելով PKR-ի ակտիվացումը, eIF2α ֆոսֆորիլացումը և արգելակելով ապոպտոտիկ բջիջների մահը:Կլինիկական առումով DARS-AS1-ը լայնորեն արտահայտված է բազմաթիվ քաղցկեղներում, և այս lncRNA-ի գերարտահայտումը վկայում է վատ կանխատեսման մասին:Այս ուսումնասիրությունը պարզաբանում է PACT-PKR ուղու քաղցկեղի հատուկ կարգավորումը DARS-AS1 lncRNA-ի կողմից և ապահովում է քաղցկեղի կանխատեսման և բուժման ևս մեկ թիրախ:
Սթրեսին հարմարվելու ունակությունը քաղցկեղի բջիջների գոյատևման և տարածման կարևոր հատկանիշն է:Քաղցկեղի արագ տարածումը և նյութափոխանակության բնութագրիչները հասնում են գագաթնակետին կոշտ միկրոմիջավայրերում՝ սննդանյութերի պակաս, հիպոքսիա և ցածր pH, որոնք կարող են առաջացնել բջիջների մահվան ազդանշանային ուղիները:Սթրեսի նկատմամբ զգայուն գեների դիսկարգավորումը, ինչպիսիք են p535-ը, ջերմային շոկի սպիտակուցները 6, 7, KRAS8, 9 և HIF-110, 11, 12, 13 հաճախ նկատվում են քաղցկեղի դեպքում՝ դրանով իսկ արգելափակելով ապոպտոզը և նպաստելով գոյատևմանը:
Protein kinase R-ը (PKR) էուկարիոտիկ մեկնարկային գործոնի 2α (eIF2α) կարևոր սթրեսի ցուցիչ և ենթամիավոր կինազ է, որը թարգմանական կարգավորիչ է, որը կապում է բջջային սթրեսը բջիջների մահվան հետ:PKR-ն ի սկզբանե ճանաչվել է որպես հակավիրուսային սպիտակուց՝ օտարերկրյա երկշղթա ՌՆԹ-ի (dsRNA) հայտնաբերմամբ:Ակտիվացումից հետո PKR-ն ֆոսֆորիլացնում է eIF2α՝ արգելակելու վիրուսային և բջջային սպիտակուցի սինթեզը14,15,16:PACT-ը (PKR activator protein) ճանաչվել է որպես առաջին PKR ակտիվացնող սպիտակուցը dsRNA17,18,19,20,21,22,23 բացակայության դեպքում:PKR-ի հետ անմիջական փոխազդեցության միջոցով PACT-ը փոխակերպում է տարբեր սթրեսներ (շիճուկի քաղց, պերօքսիդով կամ արսենիտով բուժում) դեպի PKR և ներքևի ազդանշանային ուղիներ:Բացի eIF2α ֆոսֆորիլացումից, PACT միջնորդավորված PKR-ի ակտիվացումը առաջացնում է տարբեր իրադարձություններ, որոնք կապված են սթրեսային արձագանքի հետ, ներառյալ փոփոխված ռեդոքս կարգավիճակը PI3K/Akt24 ճանապարհի միջոցով, ուժեղացված ԴՆԹ-ի վնասների ստուգումը p5325,26-ի և NF-κB27,28-ի միջոցով, կարգավորում է տրանսկրիպցիան, 29: Հաշվի առնելով իրենց կարևոր դերը սթրեսի արձագանքման, տարածման, ապոպտոզի և այլ առանցքային բջջային գործընթացներում՝ PKR-ն և PACT-ը խոստումնալից թերապևտիկ թիրախներ են բազմաթիվ հիվանդությունների, հատկապես քաղցկեղի համար30,31,32,33:Այնուամենայնիվ, չնայած այս պլեյոտրոպ ֆունկցիոնալ և կենսաբանական նշանակությանը, քաղցկեղի բջիջներում PACT/PKR ակտիվության կարգավորումը մնում է անորոշ:
lncRNA-ները 200 նուկլեոտիդից ավելի մեծ տառադարձումներ են՝ առանց սպիտակուցի կոդավորման ներուժի:Քանի որ ամբողջ գենոմի հաջորդականացման առաջադեմ նախագծերը հայտնաբերել են հազարավոր lncRNAs, 35,36 մեծ ջանքեր են գործադրվել դրանց կենսաբանական գործառույթները պարզաբանելու համար:Հետազոտությունների աճող խումբը ցույց է տվել, որ lncRNA-ները ներգրավված են բազմաթիվ կենսաբանական գործընթացներում37, ներառյալ X-քրոմոսոմի անակտիվացման կարգավորումը38,39, տպագրումը40, տառադարձումը41,42, թարգմանությունը43 և նույնիսկ քաղցկեղի աճը44,45,46,47:Այս ուսումնասիրությունները ցույց տվեցին, որ շատ lncRNAs ներգրավված են PACT/PKR ուղու մեջ:Նման ուսումնասիրություններից մեկը ցույց է տվել, որ lncRNA ASPACT-ն արգելակում է PACT տրանսկրիպցիան և ավելացնում PACT mRNA-ի միջուկային պահպանումը:Այլ ուսումնասիրություններ ցույց են տվել, որ lncRNA nc886-ը կապվում է PKR-ին և արգելակում նրա ֆոսֆորիլացումը49,50:Առայժմ lncRNA-ն կարգավորող PACT-ով միջնորդավորված PKR-ի ակտիվացումը չի հաղորդվել:
Ասպարտիլ-tRNA սինթետազի հակազգայուն ՌՆԹ 1-ը (DARS-AS1) ճանաչվել է որպես օնկոգեն lncRNA51,52,53,54:MiP-194-5p53, miP-12952 և miP-532-3p51-ի կարգավորման միջոցով DARS-AS1-ը նպաստում է, համապատասխանաբար, հստակ բջջային երիկամային բջիջների քաղցկեղի, վահանաձև գեղձի և ոչ մանր բջջային թոքերի քաղցկեղի աճին:Թոնգը և գործընկերները նաև պարզել են, որ DARS-AS1-ը նպաստում է միելոմայի առաջընթացին՝ պահպանելով 39 (RBM39) սպիտակուցի ՌՆԹ կապող մոտիվի կայունությունը:Այնուամենայնիվ, ուսումնասիրություններ չեն իրականացվել այն մասին, թե արդյոք այս lncRNA-ն ներգրավված է PACT-PKR ակտիվացման և քաղցկեղի բջիջների սթրեսային արձագանքի կարգավորման մեջ:
Այստեղ մենք իրականացրել ենք մեծածավալ գործառույթի կորստի էկրան՝ օգտագործելով CRISPRi համակարգը և պարզել, որ DARS-AS1 lncRNA-ն նպաստում է մի քանի տեսակի քաղցկեղային բջիջների տարածմանը:Բացի այդ, մենք բացահայտել ենք հիմնական մեխանիզմը. DARS-AS1-ը ուղղակիորեն կապվում է PACT-ին, արգելակում է PACT-ի և PKR-ի կապը, կանխում է eIF2α-ի ֆոսֆորիլացումը՝ ցածր PKR սուբստրատի, և, ի վերջո, արգելակում է ապոպտոտիկ բջիջների մահը:Եզրափակելով, մեր աշխատանքը բացահայտում է DARS-AS1 lncRNA-ն՝ որպես PACT-PKR ճանապարհի կարգավորիչ և քաղցկեղի բուժման և կանխատեսման հնարավոր թիրախ:
Գենոմային պրոֆիլավորման լայնածավալ ուսումնասիրությունները հայտնաբերել են քաղցկեղի հետ կապված հարյուրավոր lncRNAs:Այնուամենայնիվ, դրանց գործառույթը հիմնականում անհայտ է մնում56:Քաղցկեղի առաջընթացի մեջ ներգրավված խոստումնալից lncRNA թեկնածուներին հայտնաբերելու համար մենք կատարեցինք գործառույթի կորստի ցուցադրում SW620 կոլոռեկտալ քաղցկեղի բջիջների գծում կրճատված տարածման համար՝ օգտագործելով CRISPRi համակարգը (նկ. 1ա):SW480 և SW620 հաստ աղիքի քաղցկեղի բջջային գծերի եզակի առանձնահատկությունն այն է, որ դրանք առաջացել են մեկ հիվանդի առաջնային և երկրորդային ուռուցքներից:Սա արժեքավոր համեմատություն է ապահովում հաստ աղիքի քաղցկեղի առաջընթացի գենետիկական փոփոխություններն ուսումնասիրելու համար:Հետևաբար, մենք վերլուծեցինք կոլոռեկտալ քաղցկեղի բջջային գծերի (SW480 և SW620) տրանսկրիպտոմները՝ օգտագործելով ՌՆԹ-ի հաջորդականությունը և հրապարակված գրականությունից հավաքեցինք որոշ պոտենցիալ ֆունկցիոնալ lncRNAs:Ելնելով այս արդյունքներից՝ մենք նախագծել ենք միացված sgRNA գրադարան, որը պարունակում է 7355 sgRNA օլիգոներ, որոնք ուղղված են 971 քաղցկեղի հետ կապված lncRNAs և 500 ոչ նպատակային sgRNA օլիգոներ բացասական վերահսկողության համար (Լրացուցիչ տվյալներ 1):
Սքրինինգի սխեմատիկ ներկայացում CRISPri համակարգի միջոցով:b sgRNA հարստացում սկրինինգից հետո:Հորիզոնական կետագիծը ներկայացնում է log2 (ծալովի փոփոխություն) = ±0.58:Ուղղահայաց կետագիծը ցույց է տալիս p արժեքը = 0,05:Սև կետերը ներկայացնում են ոչ թիրախային sgRNA (նշանակված է որպես NC):Կարմիր կետերը sgRNA-ներ են, որոնք ուղղված են DARS-AS1-ին:Կապույտ կետերը sgRNA-ներ են, որոնք ուղղված են LINC00205-ին՝ նախկինում նկարագրված օնկոգեն lncRNA-ին:ծալովի փոփոխություն = (նորմալացված ընթերցում, օր 17)/(նորմալացված ընթերցում, օր 0):c DARS-AS1 sgRNA նոկդաունը արգելակել է բջիջների աճը:Սխալների գծերը ներկայացնում են երեք փորձերի ± ստանդարտ շեղումը:* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01 երկկողմանի ուսանողական t-թեստ:d DARS-AS1 արտահայտությունը ուռուցքներում (TCGA տվյալների հավաքածու):em DARS-AS1-ի արտահայտումը զուգակցված նորմալ և ուռուցքային նմուշներում BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP և COAD հիվանդների համապատասխանաբար (TCGA տվյալների բազա):p-արժեքները ստացվել են զուգակցված երկկողմանի ուսանողական t-թեստի միջոցով:
Պլազմիդը կառուցելուց և լենտիվիրուսը փաթեթավորելուց հետո մենք վերը նշված գրադարանով փոխակերպեցինք dCas9-SW620 կոլոռեկտալ քաղցկեղի բջիջների գիծը չորս անկախ վարակի փորձերի ընթացքում:Այս վարակների համար ինֆեկցիայի բազմապատկությունը (MOI) եղել է 0,1–0,3, ինչը ցույց է տալիս, որ յուրաքանչյուր բջիջ կարող է փոխարկվել միայն մեկ sgRNA-ով:18 օր in vitro կուլտուրայից հետո թիրախային sgRNA-ների հարստացման պրոֆիլը նվազեց կամ ավելացավ ցուցադրումից հետո, մինչդեռ չնպատակային հսկողության օլիգոնուկլեոտիդների թիվը համեմատաբար անփոփոխ մնաց՝ համեմատած նախաքննական պրոֆիլի հետ, ինչը ցույց է տալիս, որ մեր թիրախը խիստ հատուկ է էկրանին: գրադարան։Բրինձ.1բ և լրացուցիչ աղյուսակ 1): LINC00205-ը, որը նախկինում հաղորդվում էր, որ նպաստում է թոքերի քաղցկեղի և լյարդի քաղցկեղի առաջընթացին58,59,60, ստուգվել է (log2 (ծալովի փոփոխություն) < -0.58, p արժեքը <0.05)՝ հաստատելով այս զննման հուսալիությունը (նկ. 1b): LINC00205-ը, որը նախկինում հաղորդվում էր, որ նպաստում է թոքերի քաղցկեղի և լյարդի քաղցկեղի առաջընթացին58,59,60, ստուգվել է (log2 (ծալովի փոփոխություն) < -0.58, p արժեքը <0.05)՝ հաստատելով այս զննման հուսալիությունը (նկ. 1b): LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию հույս ունի ձեռքով legkih եւ ձեռքով печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, эвератого 5значение p <0,58. 1բ). LINC00205-ը, որը նախկինում հաղորդվում էր, որ նպաստում է թոքերի քաղցկեղի և լյարդի քաղցկեղի առաջընթացին58,59,60, բացառված էր (log2 (ծալովի փոփոխություն) <-0,58, p-արժեք <0,05), որը հաստատում է այս զննման կայունությունը (նկ. .1b) . Linc00205 之前 被 报道 可 肺癌 和 肝癌 进展 58,59,60 (LOC2 (倍数 变化) <-0.58, p 值 <0.05) (图 1 բ): Linc00205 之前 被 报道 可 肺癌 和 肝癌 进展 58,59,60 (LOC2 (倍数 变化) <-0.58, p 值 <0.05) (图 1 բ): LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию հույսի ձեռքով легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение) 1բ). LINC00205-ը, որը նախկինում հաղորդվում էր, որ նպաստում է թոքերի և լյարդի քաղցկեղի առաջընթացին58,59,60, բացառված էր (log2 (ծալովի փոփոխություն) <-0.58, p-արժեքը <0.05), որը հաստատում է այս ցուցադրության կայունությունը (նկ. .1b):
Փորձարկված բոլոր lncRNA-ների շարքում DARS-AS1-ը նույնպես զննվել է, որտեղ երեք հարակից sgRNA օլիգոնուկլեոտիդները զգալիորեն կրճատվել են մշակույթից 18 օր հետո, ինչը ենթադրում է, որ այս lncRNA-ի ոչնչացումը հանգեցնում է քաղցկեղի տարածման նվազեցմանը (նկ. 1b):Այս արդյունքը հետագայում հաստատվել է կոլոռեկտալ քաղցկեղի բջիջներում MTS-ի վերլուծությամբ, որը ցույց է տալիս, որ DARS-AS1 նոկդաունի բջիջների աճի տեմպերը միայն կիսով չափ կրճատվել են հսկիչ բջիջների համեմատ (Նկար 1c) և համահունչ են քաղցկեղի մի քանի այլ տեսակների նախորդ զեկույցներին:Երիկամների թափանցիկ բջջային քաղցկեղ, վահանաձև գեղձի քաղցկեղ և թոքերի ոչ մանր բջջային քաղցկեղ51,52,53,55:Այնուամենայնիվ, նրա գործառույթը և մոլեկուլային մեխանիզմները կոլոռեկտալ քաղցկեղում մնում են չուսումնասիրված:Հետևաբար, մենք ընտրեցինք այս lncRNA-ն հետագա ուսումնասիրության համար:
Հիվանդների մոտ DARS-AS1 արտահայտությունը ուսումնասիրելու համար մենք համապարփակ վերլուծել ենք քաղցկեղի գենոմի ատլաս (TCGA) նախագծի 10327 ուռուցքային նմուշ:Մեր արդյունքները ցույց են տալիս, որ DARS-AS1-ը լայնորեն արտահայտված է և զգալիորեն կարգավորվում է առողջ բջիջներում մի շարք ուռուցքներում, ներառյալ հաստ աղիքի ադենոկարցինոման (COAD), երիկամի մաքուր բջջային քաղցկեղը (KIRC) և երիկամային պապիլյար բջջային քաղցկեղը (KIRP):.Շատ քիչ (նկ. 1դ և Լրացուցիչ նկ. 1ա, բ): Զուգակցված առողջ/ուռուցքային նմուշների վերլուծությունը հետագայում հաստատեց DARS-AS1-ի զգալիորեն ավելի բարձր արտահայտությունը միզապարկի միզապարկի կարցինոմայի (BLCA), երիկամի երիկամի թափանցիկ բջջային քաղցկեղի (KIRC), շագանակագեղձի ադենոկարցինոմայի (PRAD), թոքերի squamous cell carcinoma (LUSC) ուռուցքներում: , արգանդի կորպուսի էնդոմետրիալ քաղցկեղ (UCEC), թոքերի ադենոկարցինոմա (LUAD), լյարդի հեպատոցելուլյար քաղցկեղ (LIHC), երիկամների երիկամային պապիլյար բջջային քաղցկեղ (KIRP) և հաստ աղիքի ադենոկարկինոմա (COAD) (p արժեքը < 0,05) (նկ. 1e–m) . Զուգակցված առողջ/ուռուցքային նմուշների վերլուծությունը հետագայում հաստատեց DARS-AS1-ի զգալիորեն ավելի բարձր արտահայտությունը միզապարկի միզապարկի կարցինոմայի (BLCA), երիկամի երիկամի թափանցիկ բջջային քաղցկեղի (KIRC), շագանակագեղձի ադենոկարցինոմայի (PRAD), թոքերի squamous cell carcinoma (LUSC) ուռուցքներում: , արգանդի կորպուսի էնդոմետրիալ քաղցկեղ (UCEC), թոքերի ադենոկարցինոմա (LUAD), լյարդի հեպատոցելուլյար քաղցկեղ (LIHC), երիկամների երիկամային պապիլյար բջջային քաղցկեղ (KIRP) և հաստ աղիքի ադենոկարկինոմա (COAD) (p արժեքը < 0,05) (նկ. 1e–m) .Զուգակցված առողջ/ուռուցքային նմուշների վերլուծությունը նաև հաստատեց DARS-AS1-ի էականորեն ավելի բարձր արտահայտվածությունը միզապարկի միզապարկի քաղցկեղի (BLCA), թափանցիկ երիկամային և երիկամային բջիջների քաղցկեղի (KIRC), շագանակագեղձի ադենոկարկինոմայի (PRAD), թոքերի squamous cell carcinoma (LUSC) ուռուցքներում:, carcinoma эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатотоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) եւ аденокарцинома толстой, (0) (p. մ) . արգանդի կորպուսի էնդոմետրիումի քաղցկեղ (UCEC), թոքերի ադենոկարցինոմա (LUAD), լյարդի հեպատոցելուլյար քաղցկեղ (LIHC), երիկամի պապիլյար բջջային քաղցկեղ (KIRP) և հաստ աղիքի ադենոկարցինոմա (COAD) (p արժեքը < 0.05) (նկ. 1e– մ) .配对 健康 / 肿瘤样本 的 分析 证实 了 DARS-AS1 在 膀胱 尿 尿 尿 膀胱 (BLCA), 肾 肾 透明 细胞癌 (kirc), 前列 腺腺癌 (PRAD), 肺鳞状 细胞癌 的 的显着 更 表达 表达, 子宫体子宫 内膜 癌 (UCEC), 肺腺癌 (Luad), 肝肝 细胞癌 (lihc), 肾 肾 乳头状 细胞癌 (kirp) 和结肠腺癌 (p 值) <0.05） (图1e-m) .配 对 健康 的 分析分析 了 DARS-OS1 在 尿尿 上 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌(Լուսն) 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 中 癌 癌 表达 内膜 癌 癌 癌 ((uCel) 肺腺癌 (luad) 肝肝 细胞癌 细胞癌 细胞癌 肾 乳头状 细胞癌 (kirp) (coad) (p 值<0.05) (图1e-m) .Առողջ/ուռուցքային զուգակցված նմուշների վերլուծությունը հետագայում հաստատեց DARS-AS1-ի դերը միզապարկի միզապարկի քաղցկեղի (BLCA), թափանցիկ երիկամային բջիջների քաղցկեղի (KIRC), շագանակագեղձի ադենոկարցինոմայի (PRAD) և թոքերի squamous cell carcinoma (LUSC) ուռուցքներում:экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатотоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) և аденокарциноме легкого (LUAD) -մ): արգանդի կորպուսի քաղցկեղի (UCEC), թոքերի ադենոկարցինոմայի (LUAD), հեպատոցելուլյար քաղցկեղի (LIHC), երիկամային պապիլյար բջջային քաղցկեղի (KIRP) և հաստ աղիքի ադենոկարցինոմայի (COAD) (p արժեքը <0,05) (Գծապատկեր 1e -m):Այս արդյունքները միասին վերցրած ցույց են տալիս, որ DARS-AS1-ը լայնորեն և բարձր արտահայտված է քաղցկեղի տարբեր տեսակների մեջ:
Քանի որ DARS-AS1-ը և DARS-ը (հակազգայական շարանը կոդավորող գենը) ունեն նույն խթանիչը և տեղակայված են միմյանց կողքին, մենք նախագծել ենք shRNA-ն հատուկ DARS-AS1-ը տապալելու համար, բայց ոչ DARS-ը (Լրացուցիչ Նկար 2a,b և Լրացուցիչ Աղյուսակ 2): .Բացի SW620-ից, մենք նաև օգտագործեցինք DARS-AS1 բարձր արտահայտիչ երեք այլ բջջային գծեր՝ ուսումնասիրելու shRNA նոկդաունի արդյունավետությունն ու գործառույթը (Լրացուցիչ Աղյուսակ 3):Մեր արդյունքները ցույց տվեցին, որ մշակված բոլոր երեք shRNA-ները հասել են առնվազն 80% DARS-AS1 նոկդաունի արդյունավետության՝ քիչ ազդեցություն ունենալով DARS mRNA-ի քանակի վրա (Լրացուցիչ նկ. 2c–f):Բացի այդ, մենք պարզեցինք, որ DARS-AS1 նոկդաունը այս shRNA-ներով զգալիորեն արգելակել է բջիջների աճը կոլոռեկտալ քաղցկեղի բջիջների SW620 (49,7%) և HCT116 (27,7%), կրծքագեղձի քաղցկեղի MBA-MD-231 (53,4%) բջջային գծերում:) և HepG2 հեպատոմայի բջջային գիծը (92,7% կրճատում), ինչպես նաև չամրացված գնդիկներ ձևավորելու նրանց կարողությունը (միջին կրճատում ~50,8%, 44,6%, 40,7% և 75,7% մեկ բջջային գծում) (նկ. 2ա,բ):SW620-ում գաղութների ձևավորման հետազոտության արդյունքները հետագայում հաստատեցին, որ DARS-AS1 shRNA-ն զգալիորեն արգելակել է բջիջների բազմացումը՝ միջինը մոտավորապես 69.6% նվազմամբ (նկ. 2c):
Վերահսկիչ shRNA-ի և DARS-AS1 shRNA-ի ազդեցությունը SW620, HCT116, MBA-MD-231 և HepG2 բջիջներում բջիջների բազմացման (ա) և սֆերոիդների ձևավորման վրա (b):գ Վերահսկիչ shRNA-ի և DARS-AS1 shRNA-ի ազդեցությունը SW620 բջիջներում գաղութների ձևավորման վրա:DARS-AS1 գերարտահայտող SW620 բջիջների բջիջների բազմացում (d), գնդաձև ձևավորում (e) և գաղութների ձևավորում (զ):Ցուցադրված տվյալները երեք փորձերի միջին ± ստանդարտ շեղումն են:* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, և *** p ≤ 0,001 երկկողմանի ուսանողական t-թեստի միջոցով:
Ֆունկցիայի կորստի ուսումնասիրությունները լրացնելու համար մենք հաջորդիվ ստեղծեցինք DARS-AS1 գերարտահայտող SW620 բջիջներ (Լրացուցիչ նկար 2g):DARS-AS1 գերարտահայտումը զգալիորեն մեծացրել է բջիջների աճը (1,8 անգամ), չխարսխված գնդաձև ձևավորումը (1,4 անգամ) և գաղութների ձևավորումը (3,3 անգամ) SW620 բջիջներում (նկ. 2d–f):Մենք հաստատեցինք այս արդյունքը՝ օգտագործելով մեկ այլ DARS-AS1 արտահայտիչ բջջային գիծ՝ A549:DARS-AS1-ի գերարտահայտման պատճառով բջիջների այս ուժեղացված բազմացումը հետագայում նկատվել է A549 բջիջներում (Լրացուցիչ Նկ. 2h, i և Լրացուցիչ Աղյուսակ 3):Միասին, շահույթի և կորստի այս ուսումնասիրությունները ցույց են տալիս, որ DARS-AS1-ը խթանում է քաղցկեղի բջիջների բազմացումը in vitro:
Հետազոտելու հիմքում ընկած մեխանիզմը, որով DARS-AS1-ը կարգավորում է բջիջների տարածումը, մենք կատարեցինք ՌՆԹ-ի ներքև վերլուծություն՝ հայտնաբերելու նրա պոտենցիալ սպիտակուցը կապող գործընկերներին:RT-qPCR արդյունքները ցույց են տվել, որ DARS-AS1-ի մոտ 86.2%-ը գտնվում է SW620 բջիջների ցիտոպլազմայում (Լրացուցիչ նկար 3ա):Այնուհետև in vitro տառադարձված բիոտինիլացված DARS-AS1-ը կամ կեղծՌՆԹ-ն ինկուբացվել է SW620 բջիջների լիզատներով, որին հաջորդում է SDS-PAGE տարանջատումը:Արծաթի հետագա ներկումը ցույց տվեց, որ հստակ շերտը (~38 կԴա) զգալիորեն հարստացել է DARS-AS1 ձգվող նմուշներում, բայց ոչ կեղծ ՌՆԹ-ի կամ ուլունքների նմուշներում (նկ. 3ա):Այս շերտը ճանաչվել է որպես PKR ակտիվացնող սպիտակուց (PACT) զանգվածային սպեկտրոմետրիայի (MS) միջոցով և հետագայում հաստատվել է իմունոբլոթինգով SW620, HCT116 և HepG2 բջջային գծերում (նկ. 3a,b):DARS-ի և հարակից PACT սպիտակուցների՝ PKR-ի և TRBP-ի հարստացումը նույնպես հետազոտվել է ՌՆԹ-ի վերլուծության միջոցով Western blotting-ով (WB):Արդյունքները ցույց տվեցին, որ DARS-AS1 ՌՆԹ-ի և այս երեք սպիտակուցների միջև ուղղակի փոխազդեցություն չի հայտնաբերվել (Լրացուցիչ նկար 3b):DARS-AS1-ի և PACT-ի հատուկ փոխազդեցությունը հետագայում հաստատվել է ՌՆԹ-ի իմունային տեղումների (RIP) վերլուծության միջոցով, որը ցույց է տվել, որ DARS-AS1-ը զգալիորեն հարստացել է հակա-PACT հակամարմիններով, բայց ոչ այլ հսկիչ ՌՆԹ-ներով (Նկար 3գ):Որոշելու համար, թե արդյոք DARS-AS1-ը ուղղակիորեն փոխազդում է PACT-ի հետ որևէ այլ բջջային բաղադրիչի բացակայության դեպքում, կատարվել է in vitro կենսաշերտային ինտերֆերոմետրիա (BLI) վերլուծություն՝ օգտագործելով մաքրված PACT:Բիոտինով պիտակավորված DARS-AS1 կամ կեղծ ՌՆԹ-ն անշարժացվել է streptavidin (SA) կենսասենսորների վրա, այնուհետև ինկուբացվել է 1 μM PACT պարունակող կինետիկ բուֆերում:Հատկանշական է, որ PACT-ը խստորեն կապված է DARS-AS1-ի հետ (KD արժեքը ~26,9 նՄ), բայց ոչ՝ նմանակող ՌՆԹ-ին (Նկար 3դ):Այս արդյունքները միասին վերցրած ցույց են տալիս անմիջական փոխազդեցություն և բարձր կապ DARS-AS1-ի և PACT-ի միջև:
ՌՆԹ-ի ձգման վերլուծությունը հայտնաբերել է DARS-AS1-ի փոխազդեցությունը PACT-ի հետ SW620 բջիջներում:Վերևում՝ հարակից սպիտակուցների արծաթի ներկում։Ստորին իմունոբլոտները կատարվել են հակա-PACT հակամարմիններով:b RNA pull-down վերլուծությունը կատարվել է HCT116 (վերևում) և HepG2 (ներքև) բջիջներում:PACT-ի հարստացումը հայտնաբերվել է իմունոբլոթինգով:cRNA immunoprecipitation (RIP) փորձարկումները կատարվել են SW620 բջիջներում՝ օգտագործելով նշված հակամարմինները:դ PACT կապող կորեր DARS-AS1-ի կամ հսկիչ ՌՆԹ-ի հետ ամբողջ երկարությամբ ստացվել են կենսաշերտերի ինտերֆերոմետրիայի (BLI) միջոցով:ՌՆԹ-ն անշարժացվել է streptavidin biosensor-ի վրա:Ասոցիացիան չափելու համար օգտագործվել է 1 μM PACT:ՌՆԹ-ի ձգման փորձարկումն իրականացվել է բիոտինիլացված ամբողջ երկարությամբ DARS-AS1-ի կամ կտրված (վերևում) օգտագործմամբ:Իմունոբլոտը ցույց է տալիս PACT ստացված (ներքևում):f Մաքրված դրոշակավորված PACT-ը ինկուբացվել է բիոտինիլացված ամբողջ երկարությամբ DARS-AS1-ով կամ կտրվել է (ինչպես e-ում) in vitro RIP վերլուծության համար:Արդյունահանված ՌՆԹ-ն ստուգվել է RT-qPCR-ով:g ՌՆԹ-ի տարբեր բեկորների հարաբերական կապը PACT-ի համար ստացվել է կենսաշերտերի ինտերֆերոմետրիայի միջոցով:Վերլուծության համար օգտագործվել են 100 նՄ ՌՆԹ և 1 մկՄ RAST:h In vitro RIP վերլուծությունները կատարվել են՝ օգտագործելով մաքրված անձեռնմխելի կամ կտրված պիտակավորված PACT:Արդյունահանված ՌՆԹ-ն ստուգվել է RT-qPCR-ով:i DARS-AS1, PACT կամ երկուսն էլ գերարտահայտող SW620 բջիջների աճի տեմպը:j SW620 բջիջներում ամբողջ երկարությամբ կամ կտրված DARS-AS1-ի գերարտահայտումը տարբեր ազդեցություն է ունեցել բջիջների աճի վրա:k Apoptosis-ը հայտնաբերվել է հակա-PARP հակամարմինով իմունոբլոթինգով:l DARS-AS1-ի նոկաուտը հրահրում է SW620 բջիջների ապոպտոզ, ինչպես ցույց է տրված հոսքի ցիտոմետրիայի միջոցով:Ցուցադրված տվյալները երեք փորձերի միջին ± ստանդարտ շեղումն են: *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, երկկողմանի ուսանողական t թեստով: *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, երկկողմանի ուսանողական t թեստով: *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 երկկողմանի ուսանողական t-թեստի միջոցով: *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 երկկողմանի ուսանողական t-թեստի միջոցով:
Այնուհետև մենք ստեղծեցինք երեք բիոտինիլացված DARS-AS1 ՌՆԹ-ի բեկորներ in vitro տրանսկրիպցիայի միջոցով՝ բացահայտելու DARS-AS1 շրջանը, որն անհրաժեշտ է PACT ասոցիացիայի համար (Նկար 3e):ՌՆԹ-ի վերլուծության արդյունքները ցույց տվեցին, որ յուրաքանչյուր հատված կարող էր փոխազդել PACT-ի հետ, սակայն 3'-տերմինալ շրջանը (384–768 նուկլեոտիդներ պիտակավորված A3) ցույց տվեց ավելի քան 1–384 նուկլեոտիդ՝ պիտակավորված A1) (նկ. 3e):Նմանատիպ արդյունքներ են նկատվել in vitro RIP վերլուծության ժամանակ՝ օգտագործելով ռեկոմբինանտ PACT (Նկար 3f):Այս արդյունքներին համապատասխան՝ անշարժացված ՌՆԹ-ի բեկորները PACT-ին կապելու փորձերը ցույց տվեցին նաև, որ PACT-ն ավելի բարձր կապ ունի A3-ի (384–768 նտ) (KD արժեքը մոտավորապես 94,6 նՄ) նկատմամբ, մինչդեռ գրեթե ոչ մի կապ այլ տարածքների հետ:(նկ. 3d):
Մենք նաև ուսումնասիրեցինք PACT-ի հետ կապված պարտադիր շրջանները:PACT-ը պարունակում է երեք ֆունկցիոնալ տիրույթ, որոնցից երկուսը պահպանված են երկշղթա ՌՆԹ կապող տիրույթներ (dsRBD) և երրորդ տիրույթը (նշանակված D3), որը գործում է որպես սպիտակուցների փոխազդեցության ակտիվացնող:Յուրաքանչյուր տիրույթի lncRNA կապող կարողությունը ուսումնասիրելու համար մենք մշակեցինք երեք մուտացիաներ, որոնք հեռացրեցին երեք տիրույթներից յուրաքանչյուրը և կատարեցին in vitro RIP վերլուծություն:Մեր արդյունքները ցույց տվեցին, որ PACT-ի երրորդ տիրույթի (D3) ջնջումը զգալիորեն նվազեցրեց դրա փոխազդեցությունը DARS-AS1-ի հետ (0.11 անգամ՝ համեմատած անձեռնմխելի PACT-ի հետ)՝ համեմատած մյուս երկու մուտացիաների (նկ. 3h), ցույց տվեց, որ թողարկումը D3-ը փոխազդեց DARS-ի հետ:-AC1.Միասին այս արդյունքները ցույց են տալիս, որ DARS-AS1-ի և PACT-ի փոխազդեցությունը կարող է առաջանալ հիմնականում DARS-AS1-ի 3' վերջի և PACT-ի D3 տիրույթի միջոցով:
Մենք նշեցինք, որ DARS-AS1-ը ոչ մի ազդեցություն չուներ PACT արտահայտման վրա, իսկ PACT-ը ոչ մի ազդեցություն չուներ DARS-AS1-ի վրա (Լրացուցիչ նկար 3c):Այնուհետև մենք ուսումնասիրեցինք PACT նոկդաունի ազդեցությունը բջիջների աճի վրա:Ի տարբերություն DARS-AS1-ի, հարաբերական բջիջներն աճեցին 1,5–3 անգամ ավելի արագ, երբ PACT-ը տապալվեց (Լրացուցիչ նկար 3d):Գաղութների ձևավորման հետազոտության արդյունքները ցույց են տվել, որ բջիջները ձևավորել են 2-3 անգամ գաղութներ PACT-ով shRNA բուժումից հետո (Լրացուցիչ նկ. 3e):Ստուգելու համար, թե արդյոք DARS-AS1-ը կարգավորում է բջիջների բազմացումը PACT-ի միջոցով, մենք ստեղծեցինք SW620 բջիջներ, որոնք գերարտահայտում են PACT, DARS-AS1 կամ երկուսն էլ:PACT-ի գերարտահայտումը ցույց տվեց բջիջների բազմացման զգալի արգելակում (Նկար 3i):Մինչ DARS-AS1 գերարտահայտումն ինքնին զգալիորեն նպաստում էր բջիջների բազմացմանը, DARS-AS1 և PACT գերարտահայտող բջիջների աճի տեմպերի մեջ էական տարբերություն չկար:Այս արդյունքները ցույց են տալիս, որ PACT-ը կարող է հակազդել DARS-AS1 գերարտահայտման հետևանքով առաջացած աճող տարածմանը:
Քանի որ DARS-AS1-ի տարբեր շրջաններ ունեն PACT-կապելու տարբեր ունակություններ, մենք ուսումնասիրեցինք դրանց հարաբերական ազդեցությունը բջիջների բազմացման վրա DARS-AS1 բեկորների տարբեր գերարտահայտման միջոցով:Համեմատած մյուս երկու բեկորների հետ, DARS-AS1-ը գերարտահայտվել էր 3' վերջում (384–768 նտ)՝ DARS-AS1-ի PACT-ի հետ կապված հիմնական շրջանը, որն ուներ բջիջների բազմացումը խթանելու ամենաբարձր ունակությունը (նկ. 3j):Այս արդյունքները ցույց են տալիս դրական հարաբերակցություն DARS-AS1-ի կապող հզորության և կենսաբանական ֆունկցիայի միջև:
Հաղորդվել է, որ PACT-ը պրո-ապոպտոտիկ սպիտակուց է19:Հետևաբար, մենք ուսումնասիրեցինք DARS-AS1-ի ազդեցությունը ապոպտոզի վրա:Ինչպես և սպասվում էր, DARS-AS1 նոկդաունը զգալիորեն մեծացրեց PARP-ի ճեղքումը SW620 բջիջներում և ավելացրեց անեքսին V-դրական բջիջների համամասնությունը SW620, HCT116, HepG2 և MBA-MD-231 բջջային գծերում (նկ. 3k):3).3f–h), ցույց տալով, որ DARS-AS1-ի հակաապոպտոտիկ ազդեցությունը քաղցկեղի բջիջներում հակասում է PACT-ի ապոպտոզ առաջացնող ֆունկցիային:Միասին այս արդյունքները ցույց են տալիս, որ DARS-AS1 օնկոգեն ֆունկցիայի մեխանիզմը կարող է լինել PACT ֆունկցիայի արգելակման միջոցով:
Հաջորդը, մենք ուսումնասիրեցինք DARS-AS1-PACT ասոցիացիայի ֆունկցիոնալ հետևանքները:Հաղորդվում է, որ PACT-ն ակտիվացնում է PKR-ն ուղղակի փոխազդեցության միջոցով, որը հետագայում ուժեղացնում է eIF2α ֆոսֆորիլացումը՝ առաջացնելով թարգմանական ջնջում և ապոպտոզ17:Նախ, մենք ուսումնասիրեցինք, թե արդյոք DARS-AS1-ն ազդում է PACT-ի և PKR-ի բջջային տեղայնացման վրա:Կոնֆոկալ ֆլուորեսցենտային մանրադիտակը ցույց է տվել, որ PACT-ը և PKR-ն բարձր տեղայնացված են SW620 բջիջներում՝ միջին Pearson հարաբերակցության գործակիցով 0,72:Միևնույն ժամանակ, DARS-AS1 գերարտահայտումը զգալիորեն նվազեցրեց PACT-ի և PKR-ի համատեղայնացումը (միջին Pearson հարաբերակցության գործակիցը 0.61) (Նկար 4ա):Հետաքննելու համար, թե արդյոք DARS-AS1-ը կարող է մոդուլացնել PACT-PKR փոխազդեցությունը, մենք իրականացրեցինք համակի իմունային նստվածքի (co-IP) փորձարկում հակա-PACT հակամարմիններով SW620 բջիջների լիզատներում:PKR-ն խիստ հարստացված է հակա-PACT-ով հսկիչ բջիջներում, մինչդեռ PKR-ի վերականգնումը զգալիորեն կրճատվել է DARS-AS1 գերարտահայտող բջիջների լիզատներում (նկ. 4b):Մաքրված պիտակավորված PACT-ը և PKR-ն օգտագործվել են in vitro սպիտակուցների կապակցման փորձարկումների համար:Համապատասխանաբար, նրանք, որոնք տրամադրել են DARS-AS1, բայց ոչ վերահսկիչ ՌՆԹ, ցույց են տվել ճնշված PACT-PKR փոխազդեցություն (Նկար 4c):Բոլոր արդյունքները ցույց են տվել, որ DARS-AS1-ը խաթարել է PACT և PKR հաղորդակցությունը:
PACT-ի և PKR-ի համատեղ տեղայնացում վերահսկիչ բջիջներում կամ DARS-AS1 գերարտահայտող բջիջներում դիտվել է կոնֆոկալ ֆլուորեսցենտային մանրադիտակի միջոցով:Միջուկները ներկվել են DAPI-ով:Վիճակագրական արդյունքներ են ստացվել 16 լուսանկարից։b Համատեղ իմունոպրեցիպիտացիա (co-IP) հակա-PACT հակամարմինների օգտագործմամբ վերահսկվող SW620 բջիջների բջիջների լիզատներում կամ DARS-AS1 գերարտահայտող բջիջներում:c Նշված PACT, մաքրված PKR և արտագրված in vitro DARS-AS1-ով կամ կեղծ ՌՆԹ-ով ինկուբացվել են in vitro սպիտակուցների կապակցման վերլուծության համար:Իմունային նստվածքների համար օգտագործվել են հակադրոշակային հակամարմիններ:d Նշված հակամարմիններով իմունոբլոթեր են կատարվել SW620 և HCT116 բջիջներում, որոնք փոխակերպվել են հսկիչ shRNA-ով կամ DARS-AS1-shRNA-ով, որին հաջորդում է շիճուկի քաղցը:e DARS-AS1 արտահայտման մակարդակը փոխել է բջջային զգայունությունը թապսիգարգինի նկատմամբ:SW620 բջիջները տրանսֆեկցվել են DARS-AS1 shRNA, DARS-AS1 գերարտահայտման պլազմիդի կամ հսկիչ պլազմիդի միջոցով:Բջիջները բուժվել են թապսիգարգինով 48 ժամվա ընթացքում, և բջիջների կենսունակությունը որոշվել է MTS ռեագենտի միջոցով:f In vitro տառադարձված DARS-AS1 կամ կեղծ ՌՆԹ-ն և մաքրված PACT-ն օգտագործվել են in vitro ակտիվացման հետազոտության և իմունոբլոտի հայտնաբերման համար:g Իմունոբլոտներ՝ օգտագործելով այս հակամարմինները, կատարվել են SW620-ctrl բջիջների (ձախից) կամ PKR մուտանտների գերարտահայտման բջիջների վրա (աջ):Այս բջիջներն այնուհետև փոխակերպվել են հսկիչ shRNA-ով կամ DARS-AS1-shRNA-ով, որին հաջորդում է շիճուկի քաղցը:h Flow cytometry-ը ցույց է տվել, որ մուտանտի PKR-ի ինակտիվացումը փոխհատուցում է DARS-AS1-ով առաջացած ապոպտոզը SW620 բջիջներում:i Իմունոբլոթեր նշված հակամարմիններով կատարվել են SW620 (ձախ) կամ HCT116 (աջ) բջիջներում:Վերահսկիչ shRNA-ով կամ DARS-AS1 shRNA-ով փոխակերպված բջիջները զրկված են շիճուկից և լրացվում են 100 նՄ PKR C16 ինհիբիտորով կամ DMSO-ով:Սանդղակի սանդղակը = 5 մկմ:Ցուցադրված տվյալները երեք փորձերի միջին ± ստանդարտ շեղումն են:* p ≤ 0.05 երկկողմանի ուսանողական t-թեստ:
Ընդհանրապես ենթադրվում է, որ երբ PACT-ը փոխազդում է PKR17-ի հետ, PKR ֆոսֆորիլացումը Thr451-ում կարող է առաջանալ:Մեր արդյունքները ցույց տվեցին, որ PKR ֆոսֆորիլացման մակարդակը զգալիորեն բարձրացել է DARS-AS1 նոկդաունի բջիջներում շիճուկի սովից հետո (նկ. 4d և լրացուցիչ նկ. 4ա):Համապատասխանաբար, մենք պարզեցինք, որ eIF2α-ի՝ հիմնական PKR սուբստրատի ֆոսֆորիլացումը նույնպես զգալիորեն ավելացել է DARS-AS1 shRNA-ի կողմից (նկ. 4d և լրացուցիչ նկ. 4ա):Thapsigargin-ը ER սթրեսոր է, որը ստիպում է ER-ից ազատել Ca2+:Նշվում է, որ թապսիգարգինով բուժումը հրահրում է PACT-ի արտահայտումն ու ակտիվացումը, որը հետագայում փոխազդում և ակտիվացնում է PKR-ի հետ՝ հանգեցնելով ապոպտոզի՝ մեծացնելով eIF2α ֆոսֆորիլացումը 18,61:Այստեղ մենք օգտագործեցինք թապսիգարգինը որպես PACT/PKR ուղու խթանիչ՝ պարզելու, թե արդյոք DARS-AS1-ը կարող է օգնել բջիջներին հաղթահարել սթրեսը՝ արգելակելով PACT/PKR ուղին:Մենք նկատեցինք, որ DARS-AS1 արտահայտման մակարդակը դրականորեն փոխկապակցված է թապսիգարգինի նկատմամբ բջիջների դիմադրության հետ:DARS-AS1 գերարտահայտող SW620 բջիջները ավելի լավ են գոյատևել, երբ բուժվել են թապսիգարգինով, մինչդեռ DARS-AS1 նոկդաունով բջիջները դարձել են ավելի զգայուն (նկ. 4e):Այս արդյունքներին համահունչ՝ DARS-AS1 գերարտահայտումը նվազեցրեց թապսիգարգինի կողմից առաջացած PKR ֆոսֆորիլացումը (Լրացուցիչ Նկ. 4b):Ի հակադրություն, թապսիգարգինի բուժումից հետո PKR-ն և eIF2α-ն ավելի մեծ չափով ֆոսֆորիլացվել են DARS-AS1 նոկդաունի բջիջներում՝ համեմատած հսկիչ բջիջների հետ (Լրացուցիչ նկար 4b):Հետաքրքիր է, որ thapsigargin-ը դրդել է DARS-AS1-ի արտահայտումը դոզայից կախված ձևով, ինչը կարող է ցույց տալ DARS-AS1-ի հակասթրեսային ֆունկցիան (Լրացուցիչ նկար 4c):Բացի այդ, մենք կատարել ենք in vitro ակտիվացման անալիզներ՝ հաստատելու այս դիտարկումները:Համառոտ, PKR-ն մաքրվել է բջիջների լիզատներից՝ օգտագործելով հակա-PKR հակամարմին, այնուհետև ինկուբացվել է ռեկոմբինանտ PACT-ով և DARS-AS1 արտագրված in vitro-ով:Ֆերմենտային ռեակցիայից հետո ֆոսֆո-PKR-ն հայտնաբերվել է WB-ի միջոցով:Մեր արդյունքները ցույց տվեցին, որ PKR ֆոսֆորիլացումը զգալիորեն արգելակվել է DARS-AS1-ով, բայց ոչ հսկիչ ՌՆԹ-ով (Նկար 4f):Այս in vitro և in vivo արդյունքները ցույց են տալիս, որ DARS-AS1-ն արգելակում է PACT միջնորդավորված PKR ակտիվացումը:Միևնույն ժամանակ, մենք նաև նկատեցինք PACT-ի վերականգնման նվազում DARS-AS1-ի առկայության դեպքում (Նկար 4f):Այս արդյունքը համահունչ է in vitro սպիտակուցը կապող հետազոտության արդյունքներին (Նկար 4c) և կրկին ցույց է տալիս DARS-AS1-ի արգելափակման գործառույթը PACT-PKR ասոցիացիայի համար:
Ser246-ը և Ser287-ը PACT-ի D3 տիրույթում անհրաժեշտ են PKR-ի ակտիվացման համար բջջային սթրեսի պայմաններում:Ալանինով երկու սերինի մնացորդների փոխարինումը տվել է մուտանտ PACT (mutD), որն ակտիվացրել է PKR-ն սթրեսի բացակայության դեպքում, իսկ ալանինի (mutA) փոխարինումը հակադարձել է արձանագրությունը:Քանի որ մենք ցույց ենք տվել այս տիրույթի կարևորությունը DARS-AS1-ի հետ անմիջական կապի մեջ, մենք ստեղծեցինք այս երկու PACT մուտանտները՝ ստուգելու համար, թե արդյոք այդ մնացորդները կարող են նաև ներգրավվել DARS-AS1-ի հետ փոխազդեցության մեջ:Հետաքրքիր է, որ երկու մուտանտներն էլ կորցրել են DARS-AS1-ի հետ կապվելու ունակությունը (Լրացուցիչ նկ. 4d), ինչը ենթադրում է, որ PACT սպիտակուցի ամբողջական կառուցվածքը կարող է պահանջվել DARS-AS1-ի հետ արդյունավետ փոխազդեցության համար:
Ավելին, մեր արդյունքները նաև ցույց են տալիս, որ DARS-AS1-shRNA-ի ազդեցությամբ բջիջների բազմացման արգելակումը կարող է մասամբ վերականգնվել՝ գերակշռող բացասական PACT մուտանտի (PACTmutA) կամ գերիշխող բացասական PKR մուտանտի (PKRmut) գերակշռող բացասական արտահայտման միջոցով (Լրացուցիչ նկար 4e. e):Գերիշխող-բացասական PKR մուտանտների գերարտահայտումը նվազեցրել է PKR ֆոսֆորիլացումը, որն առաջացել է DARS-AS1 նոկդաունով, ինչպես նաև eIF2α ֆոսֆորիլացում շիճուկից զրկված բջիջներում (նկ. 4g):Ավելի կարևոր է, որ DARS-AS1 նոկդաունով առաջացած ապոպտոտիկ բջիջների մասնաբաժինը նույնպես կրճատվել է PKRmut գերարտահայտող բջիջներում (նկ. 4h և լրացուցիչ նկ. 4g):PKR kinase-ի ակտիվության արգելակումը նաև խաթարում է DARS-AS1 ֆունկցիան, քանի որ արդյունքները ցույց են տվել, որ DARS-AS1 նոկդաունը հազվադեպ է առաջացնում PKR և eIF2α ֆոսֆորիլացում, երբ բջիջները մշակվում են PKR-հատուկ C16 ինհիբիտորով (նկ. 4i և լրացուցիչ Նկ. 4h):)Միասին մեր արդյունքները ցույց են տալիս, որ DARS-AS1-ը խթանում է բջիջների բազմացումը, գոնե մասամբ՝ արգելակելով PACT միջնորդավորված PKR ակտիվացումը:
DARS-AS1-ի դերը ուռուցքի առաջացման մեջ հետագա ուսումնասիրելու համար մենք կատարեցինք in vivo փորձեր՝ օգտագործելով մկների քսենոփոխպատվաստման մոդելը: Արդյունքները ցույց են տալիս, որ DARS-AS1-ի նոկդաունը կտրուկ նվազեցրեց ուռուցքի աճը մկների մոտ (p արժեքը <0,0001) (նկ. 5ա): Արդյունքները ցույց են տալիս, որ DARS-AS1-ի նոկդաունը կտրուկ նվազեցրեց ուռուցքի աճը մկների մոտ (p արժեքը <0,0001) (նկ. 5ա): Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (значение p <0,0001) (рис. 5а). Արդյունքները ցույց են տալիս, որ DARS-AS1 նոկդաունը կտրուկ նվազեցնում է մկների ուռուցքի աճը (p արժեքը < 0,0001) (Նկար 5ա):结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0.0001）（图5a）结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0.0001）（图5a）、 Результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей (значение р <0,0001) (рис. 5а): Արդյունքները ցույց տվեցին, որ DARS-AS1 նոկդաունը զգալիորեն նվազեցրեց ուռուցքի աճը մկների մոտ (p արժեքը <0,0001) (Նկար 5ա):Այսպիսով, DARS-AS1 նոկդաունի խմբում գրանցվել է ուռուցքի միջին ծավալի զգալի նվազում մոտ 72,9%-ով և միջին ուռուցքի զանգվածի մոտ 87,8%-ով (Նկար 5b-d):Այս արդյունքները վճռականորեն ցույց են տալիս, որ DARS-AS1-ը կարող է զգալիորեն խթանել ուռուցքի աճը in vivo-ում:
DARS-AS1 նոկդաունի գովազդի ազդեցությունը մերկ մկների կոլոռեկտալ օնկոգենեզի վրա:Ցուցադրված են աճի կորերը (ա), ուռուցքի չափը (բ), քաշը (գ) և ուռուցքի պատկերները (դ):Սխալների գծերը ներկայացնում են ±SEM: n = 10. ****p < 0,0001, երկկողմանի ուսանողական t թեստով: n = 10. ****p < 0,0001, երկկողմանի ուսանողական t թեստով: n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0,0001 երկու պոչ ուսանողի t-թեստ.n = 10: ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 ****p < 0,0001，通过双尾学生t检验。 ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p < 0.0001 երկու պոչ ուսանողի t-test.e Kaplan-Meier-ը վերլուծել է DARS-AS1 արտահայտման մակարդակների և ընդհանուր գոյատևման միջև կապը UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM և LGG ունեցող հիվանդների մոտ:Հիվանդների մոտ DARS-AS1 արտահայտվածության բարձր մակարդակը եղել է լավագույն 50%-ում;DARS-AS1 արտահայտման ցածր մակարդակը հիվանդների մոտ եղել է ստորին 50%-ում:p-արժեքները որոշվել են լոգարիթմական թեստի միջոցով:f Առաջարկված մոդել, որտեղ DARS-AS1-ը կարգավորում է PACT-PKR ուղին և ուռուցքի աճը:
DARS-AS1-ի կլինիկական ազդեցությունը ավելի լավ հասկանալու համար մենք ուսումնասիրեցինք դրա արտահայտման և հիվանդի գոյատևման միջև կապը:Վերլուծելով TCGA տվյալների բազան՝ մենք պարզեցինք, որ ավելի բարձր DARS-AS1 արտահայտությունը կապված է ուվեալ մելանոմայի (UVM), երիկամային քրոմոֆոբիայի (KICH), երիկամային պապիլյար բջջային քաղցկեղի (KIRP), մեսոթելիոմայի (MESO), մուլտիպլեքսների հետ:Ավելի ցածր գոյատևումը զգալիորեն կապված էր գլիոբլաստոմայի մորֆոզի (GBM) և ուղեղի ցածր աստիճանի գլիոմայի (LGG) հիվանդների հետ (Նկար 5e):Այս արդյունքները ցույց են տալիս, որ DARS-AS1-ը կարող է կարևոր դեր խաղալ ուռուցքի կլինիկական առաջընթացի մեջ և կարող է լինել պոտենցիալ կանխատեսող բիոմարկեր բազմաթիվ քաղցկեղների դեպքում:
Այս ուսումնասիրության մեջ, օգտագործելով լայնածավալ CRISPRi ֆունկցիոնալ սկրինինգը, մենք որոշեցինք, որ DARS-AS1 lncRNA-ն հաղթահարում է քաղցկեղային բջիջների սթրեսը՝ կարգավորելով երկու հիմնական սթրես արձագանքողներ՝ PACT և PKR:Անմիջականորեն փոխազդելով PACT-ի հետ՝ DARS-AS1-ը արգելակեց PACT-ով միջնորդավորված PKR ակտիվացումը՝ դրանով իսկ կանխելով ապոպտոտիկ բջիջների մահը և խթանելով բջիջների բազմացումը (նկ. 5f):DARS-AS1-ի վերակարգավորումը նկատվել է քաղցկեղի բազմաթիվ տեսակների դեպքում՝ ենթադրելով, որ սթրեսային պայմաններում քաղցկեղի բջիջների գոյատևման խթանման գործառույթը կարող է լայնորեն կիրառելի քաղցկեղի բազմաթիվ տեսակների դեպքում:
PACT-ը ճանաչվել է որպես PKR ակտիվացնող սպիտակուց, և PACT-ի միջնորդավորված PKR ակտիվացումը կարևոր դեր է խաղում սթրեսային արձագանքներում՝ կարգավորելով տրանսկրիպցիան, թարգմանությունը, ապոպտոզը և այլ կարևոր բջջային գործընթացները62:Տասնամյակներ շարունակ փորձեր են արվել հասկանալու PACT-PKR կասկադի քաղցկեղի հատուկ կարգավորումը:Այստեղ մեր ուսումնասիրությունը բացահայտեց PACT-PKR-ի կարգավորման այլ մեխանիզմ քաղցկեղային բջիջներում բջջային lncRNA DARS-AS1-ի միջոցով, որն ուղղակիորեն կապվում է PACT-ի հետ, արգելափակում է PACT-PKR փոխազդեցությունը, արգելակում է PKR-ի ակտիվացումը և eIF2α ֆոսֆորիլացումը՝ դրանով իսկ արգելելով սթրեսից առաջացած ապոպտոզի և խթանելով քաղցկեղի վերջնական տարածումը:բջիջները.Այս հայտնագործությունը լույս է սփռում քաղցկեղի կանխատեսման և թերապիայի lncRNA պոտենցիալ թիրախների վրա:
Մեր տվյալները ցույց տվեցին, որ DARS-AS1 նոկդաունը զգայունացնում է բջիջները շիճուկի սովի նկատմամբ՝ ֆոսֆորիլացված PKR-ի և eIF2α-ի զգալի աճով:Այս արդյունքները ցույց են տալիս, որ DARS-AS1-ը նպաստում է քաղցկեղի բջիջների գոյատևմանը ծանր պայմաններում՝ արգելակելով PACT/PKR գործունեությունը:Մի քանի այլ ոչ կոդավորող ՌՆԹ-ներ, ինչպիսիք են ASPACT-ը և nc886-ը, նույնպես ներգրավված են PACT/PKR առանցքում՝ նվազեցնելով PACT48 mRNA-ն կամ կարգավորելով ավտոֆոսֆորիլացումը՝ կապվելով PKR49,50,64-ին:Դրանցից DARS-AS1-ը հանդես է գալիս որպես PACT-PKR ասոցիացիայի խանգարող:Այս ուսումնասիրությունը հարստացնում է PACT/PKR առանցքի կարգավորման մեր պատկերացումները և lncRNA-ների դերը սթրեսային արձագանքներում:
PACT-ը պարունակում է երեք առանձին տիրույթ:Առաջին երկու dsRBD-ներից յուրաքանչյուրը բավարար է PACT-ի PKR-ի հետ բարձր մերձեցման կապը ձեռք բերելու համար, մինչդեռ երրորդ տիրույթը (D3) պահանջվում է PKR-ի ակտիվացման համար in vitro և in vivo:Մեր ուսումնասիրությունը ցույց տվեց, որ DARS-AS1-ը գերադասելիորեն փոխազդում է D3 տիրույթի հետ (նկ. 3h):Հաշվի առնելով lncRNA-ի (768 նուկլեոտիդների) մեծ չափը, DARS-AS1-ը D3-ին միանալը կարող է ֆիզիկապես արգելակել dsRBD-ի և PKR-ի PACT տիրույթի փոխազդեցությունը՝ դրանով իսկ արգելափակելով PACT-ի և PKR-ի կապը:PACT կետային մուտացիաները, որոնք D3-ում Ser246-ին և Ser287-ին փոխարինեցին ալանինով կամ ասպարտատով, խաթարեցին դրա կապակցումը DARS-AS1-ի հետ՝ մատնանշելով D3-ի ընդհանուր կառուցվածքային և էլեկտրական հատկությունների կարևորությունը դրանց ասոցիացիայում:Այս մեխանիզմի լրացուցիչ մանրամասները կպահանջվեն ապագայում՝ օգտագործելով ավելի ճշգրիտ կենսաքիմիական վերլուծություն և բարձր լուծույթով PACT կառուցվածքային վերլուծություն:
Նախորդ ուսումնասիրությունները հայտնել են, որ DARS-AS1-ը նպաստում է բջիջների բազմացմանը մի քանի մեխանիզմների միջոցով51,52,53:Օրինակներից մեկում հետազոտողները նկատել են, որ DARS-AS1-ը վերակարգավորել է իր հակազգայական սպիտակուցը կոդավորող DARS գենը՝ թիրախավորելով miP-194-5p երիկամների քաղցկեղի բջիջներում:Այնուամենայնիվ, ներկա ուսումնասիրության մեջ DARS-AS1 նոկդաունը քիչ ազդեցություն ունեցավ DARS-ի տրանսկրիպցիայի վրա քաղցկեղի բազմաթիվ տեսակների դեպքում, ներառյալ առնվազն կոլոռեկտալ, կրծքագեղձի և լյարդի քաղցկեղը:Քանի որ lncRNA-ները ցուցադրում են բջիջների և հյուսվածքների հատուկ արտահայտման օրինաչափություններ, ֆունկցիոնալ մեխանիզմները կարող են չպահպանվել քաղցկեղի տեսակների մեջ, ինչը կարող է նպաստել մեր դիտարկումների և տարբեր քաղցկեղների նախկին գնահատումների միջև այս անհամապատասխանությանը:Հատուկ ուսումնասիրություններ են անհրաժեշտ տարբեր ֆիզիոլոգիական և պաթոլոգիական պրոցեսների կոնկրետ մեխանիզմները պարզելու համար:
Կլինիկական տվյալների վերլուծությունը ցույց է տվել, որ DARS-AS1 արտահայտվածությունը ուռուցքներում հակադարձ փոխկապակցված է քաղցկեղով հիվանդների գոյատևման հետ, ինչը ընդգծում է DARS-AS1/PACT/PKR առանցքի կարևորությունը քաղցկեղի կանխատեսման մեջ:Եզրափակելով, մեր ուսումնասիրությունը ցույց է տալիս, որ DARS-AS1-ը PACT/PKR ազդանշանային առանցքի կարգավորողն է, նպաստում է քաղցկեղի բջիջների տարածմանը և արգելակում է ապոպտոսը սթրեսային արձագանքի ժամանակ, ինչը ապահովում է հետազոտությունների ևս մեկ գիծ և հետաքրքրություն է ներկայացնում պոտենցիալ բուժման հետագա հետազոտությունների համար: .
Մարդկային բջջային գծերը SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 և HEK293T ստացվել են Չինաստանի Բջջային գծերի ազգային ենթակառուցվածքից:Բոլոր բջիջները պահպանվել են DMEM միջավայրում (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)՝ համալրված 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) և 1% պենիցիլին-streptomycin (Thermo Fisher Scientific) 37°C ջերմաստիճանում, 5% CO2:ինկուբատոր.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Anti-PKR, Abcam (ab184257);Anti-PKR (ֆոսֆո-T451), Abcam (ab81303);Anti-Flag, Abcam (ab125243);Anti-eIF2α, Abcam (A0764));հակա-eIF2α (ֆոսֆոր S51), Abcam (ab32157);anti-PACT (ֆոսֆոր S246), Abgent (AP7744b);հակա-β-տուբուլին, CST (2128);նորմալ մկնիկի IgG, CST (5415S);նորմալ նապաստակի IgG, CST (2729S):Հակամարմինները նոսրացվել են 1:1000 PBST-ում Western blotting-ի համար և 1:100 IP-ի համար:
sgRNA-ները մշակվել են՝ օգտագործելով հանրությանը հասանելի գործիք, որը կոչվում է CRISPR-ERA66:Մենք օգտագործել ենք լռելյայն գործիքի պարամետրերը sgRNA-ի մշակման համար և ալգորիթմը հաշվարկել է sgRNA կապող վայրերը 3 կբ տարածքում:կենտրոնացած է TSS-ում:sgRNA օլիգոնուկլեոտիդների լողավազաններ սինթեզվել են CustomArray, Inc.-ում (Bothewell, WA) և կլոնավորվել հումանիզացված pgRNA պլազմիդների մեջ (Addgene #44248):Ընդհանուր 12 մկգ մարդասիրական pgRNA պլազմիդ, 7,2 մկգ psPAX2 (Addgene #12260) և 4,8 մկգ pMD2.G (Addgene #12259) համատրանսֆեկցվել են 5 x 106 HEK293T՝ ԴՆԹ-ի վերափոխման միջոցով, օգտագործելով 10 սմ վերափոխում: բջիջները (CWBIO, Պեկին, Չինաստան)՝ հետևելով արտադրողի հրահանգներին:Վիրուս պարունակող սուպերնանտները հավաքվել են տրանսֆեկցիայից 48 և 72 ժամ հետո և զտվել 0,45 մկմ ֆիլտրի միջով:Սքրինինգի համար SW620 բջիջները, որոնք արտահայտում են dCas9/KRAB միաձուլման սպիտակուցը, ստացվել են վիրուսի փոխակերպման միջոցով:Փոփոխված SW620 բջիջները վարակվել են վիրուսային գրադարանով չորս անկախ վարակի փորձերի ժամանակ 0.1-0.3 MOI-ում և նմուշառվել 2 մկգ/մլ պուրոմիցինով (Sigma, St. Louis, MO) 2 օրվա ընթացքում:Այնուհետև, բջիջները մշակվել են 18 օր in vitro՝ 500 բջիջ/sgRNA նվազագույն գրադարանային ծածկույթով՝ սկրինինգի համար:
Գենոմային ԴՆԹ-ն արդյունահանվել է QIAamp DNA Blood Midi փաթեթի ցուցումների համաձայն (QIAGEN, Դյուսելդորֆ, Գերմանիա; 51183):Ընդհանուր առմամբ, գրադարանի կառուցման համար օգտագործվել է 100 մկգ գենոմային ԴՆԹ յուրաքանչյուր կենսաբանական կրկնության համար:sgRNA շրջանն ուժեղացվել է PCR-ի երկու փուլով և կապվել շտրիխ կոդի հետ:
PCR արտադրանքները մաքրվել են NucleoSpin® գելի և PCR մաքրման հավաքածուի միջոցով (MACHEREY-NAGEL, Düren, Գերմանիա; 740609.250) և քանակականացվել են Qubit™ HS երկշղթա ԴՆԹ հայտնաբերման հավաքածուի միջոցով (Thermo Fisher Scientific; Q32854):
ՄՏՍ-ի անալիզը օգտագործվել է բջիջների տարածումը չափելու համար:Բջիջները ցանվել են 96 ջրհորի թիթեղներում՝ 2000 բջիջ/հոր նախնական խտությամբ:Բջիջների հարաբերական թիվը չափվել է ամեն օր նշված ժամին` ընդհանուր 4-6 օր:Յուրաքանչյուր հորի համար 20 մկլ MTS ռեագենտ (Promega) նոսրացրել են 100 μl DMEM-ով, 4 ժամ ինկուբացրել բջիջներով 37°C-ում, այնուհետև չափվել է OD490:
Անխարսխված աճի կարողությունը հայտնաբերվել է ոլորտների ձևավորման վերլուծությամբ:Համառոտ, 2000 բջիջ, որոնք փոխակերպվել են shRNA DARS-AS1-ով կամ վերահսկիչ shRNA-ով, մշակվել են ծայրահեղ ցածր կցվող միկրոպլատներում (Corning) միջին փոփոխությամբ յուրաքանչյուր 4 օրը մեկ:Սֆերոիդները հաշվվել են 14 օր հետո։500 բջիջ, որոնք փոխակերպվել են DARS-AS1 գերարտահայտման պլազմիդի կամ հսկիչ պլազմիդի միջոցով, օգտագործվել են ուժեղացման վերլուծության համար, հակառակ դեպքում մեթոդն անփոփոխ էր:
ՌՆԹ-ն արտագրվել է T7 RNA պոլիմերազի և բիոտին-16-UTP-ի (Roche 1138908910) միջոցով՝ Riboprobe® Combination Systems-ի (Promega P1440) ցուցումների համաձայն:Այստեղ օգտագործվող այբբենարանները թվարկված են Լրացուցիչ Աղյուսակ 4-ում:
Սպիտակուցը կոդավորող PACT կամ PKR շրջանները կլոնավորվել են pET15b (Addgene #73619) և փոխակերպվել են BL21 (DE3):Բակտերիաները գիշերվա ընթացքում ինկուբացվել են ամպիցիլինի հետ մատակարարված LB-ում, այնուհետև 100 անգամ նոսրացրել թարմ LB-ով:Երբ միջավայրի OD600-ը հասավ 0,8-ի, ավելացվեց 1 մՄ IPTG՝ պրոտեինի արտահայտումը հրահրելու համար:Գիշերվա ընթացքում մեղմ թափահարումով ինկուբացիայից հետո (250 rpm 20°C-ում), բջջային գնդիկը հավաքվել է ցենտրիֆուգմամբ (4000 rpm, 10 min, 4°C):Բջջային կարկուտը նորից կասեցրեք լիզի բուֆերի մեջ (50 մՄ Տրիս, pH 8.0, 250 մՄ NaCl, 1 մՄ PMSF) և ինկուբացրեք սառույցի վրա 30 րոպե, այնուհետև արտաձայնացրեք (15 րոպե, 5 վրկ միացում/անջատում, սառույցի վրա) և ցենտրիֆուգեք (13000): rpm):, 30 րոպե, 4°С):Այնուհետև վերին նյութը բեռնվել է Ni-NTA խեժի վրա (QIAGEN) 3 անգամ 4°C ջերմաստիճանում, 4 անգամ լվանալ լվացքի բուֆերով (50 մՄ Տրիս, pH 8,0, 40 մՄ իմիդազոլ, 250 մՄ NaCl) և 3 անգամ ողողվել՝ ընդհանուր առմամբ: 10 մլ էլուենտի բուֆեր (50 մՄ Տրիս, pH 8.0, 250 մՄ NaCl, 300 մՄ իմդազոլ):Մաքրված սպիտակուցը որոշվել է WB-ի միջոցով, իսկ կոնցենտրացիան որոշվել է Qubit™ սպիտակուցի փորձարկման հավաքածուի միջոցով (Thermo Fisher Scientific; Q 33212):
RIP վերլուծությունները կատարվել են ինչպես նախկինում նկարագրված՝ փոփոխություններով:Համառոտ, 1x RIP բուֆեր (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5% NP-40, RNasin ribonuclease inhibitor (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, protease) lyses71 xcyto: (Roche, 1 mM DTT) և ցենտրիֆուգեք 13000 պտ/րոպում 15 րոպե 4 °C-ում:Այնուհետև վերին նյութը ինկուբացվել է A+G մագնիսական բշտիկներով (Millipore)՝ զուգակցված 5 մկգ հակա-PACT հակամարմինով (Abeam) կամ IgG (CST):Բշտիկները 5 անգամ լվացվել են 5x RIP բուֆերով, ապա մարսվել պրոտեինազ K-ով (NEB):ՌՆԹ-ն արդյունահանվել է Trizol-ով և որոշվել RT-qPCR-ով:Այբբենարանները ներկայացված են Լրացուցիչ Աղյուսակ 5-ում:
In vitro RIP վերլուծությունը կատարվել է ըստ փոփոխված ստանդարտ RIP փորձարկման արձանագրության:Ընդհանուր առմամբ 5 pmol in vitro արտագրված ՌՆԹ-ն 1 անգամ նոսրացվել է RIP բուֆերով և զտվել ինկուբացիայի միջոցով 65°C-ում 5 րոպե, որին հաջորդել է դանդաղ սառեցումը մինչև սենյակային ջերմաստիճան:Ընդհանուր առմամբ 5 pmol անձեռնմխելի կամ մուտացված դրոշով պիտակավորված PACT սպիտակուցներ մաքրվել են E. coli-ից:Ինկուբացրեք վերականգնված ՌՆԹ-ով 2 ժամ 4°C-ում և հետևեք վերը նշված ընթացակարգին RIP վերլուծության համար հակադրոշակի IP-ի համար:
ՌՆԹ-ի ընդլայնման վերլուծության համար 1×107 բջիջները լիզվել են 1xRIP բուֆերով:13000 rpm-ում ցենտրիֆուգումից հետո 15 րոպե 4°C-ում, գերնույն նյութը նախապես մշակվել է 30 μl streptavidin մագնիսական ուլունքներով (Beckman) 2 ժամ 4°C-ում:Այնուհետև մաքրված լիզատը մատակարարվեց խմորիչ tRNA-ով և ինկուբացվեց 40 pmol վերականգնված ՌՆԹ-ով գիշերում 4°C-ում, այնուհետև ևս 2 ժամ և ավելացվեց 20 մկլ նոր streptavidin մագնիսական ուլունքներ, որոնք արգելափակված էին BSA-ով:Լվացքի փուլը բաղկացած էր 4 անգամից՝ 5x RIP բուֆերով և 4 անգամից՝ 1x RIP բուֆերով:Համապատասխան սպիտակուցները զտվել են բիոտինի էյուցիոն բուֆերով (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 12.5 mM D-biotin, PMSF) և առանձնացվել NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen) վրա:Արծաթի ներկումից հետո (Beyotime Biotechnology) որոշ շերտեր հեռացվել և վերլուծվել են MS-ով:
Կատարվել է Co-IP վերլուծություն PACT-ի և PKR-ի միջև փոխազդեցությունը ստուգելու համար:Հակիրճ, գերնատական ​​լիզատները պատրաստվել են 1 x 107 լիզված բջիջների ինկուբացիայի միջոցով 1 x RIP բուֆերում, որին հաջորդում է ցենտրիֆուգումը 13000 rpm-ում 15 րոպե 4°C-ում:Լիզատները լիցքավորվել են A + G սպիտակուցով մագնիսական բշտիկներով, միացվել են 5 մկգ հակա-PACT հակամարմիններով և մեղմորեն պտտվել գիշերը 4°C-ում:Բշտիկները լվացվել են 3 անգամ 5×RIP բուֆերով, երկու անգամ՝ 1×RIP բուֆերով և զտվել 1×SDS բուֆերով:Վերականգնված սպիտակուցը վերլուծվել է SDS-PAGE գելով և հայտնաբերել WB-ով:
Երկու pmol դրոշակավորված PACT և 1 pmol PKR մաքրվել են E. coli-ից:Նոսրացրեք 1× RIP բուֆերի մեջ և ինկուբացրեք 10 pmol վերականգնված ՌՆԹ-ով 2 ժամ 4 °C-ում:Դրանից հետո նրանց ինկուբացրել են A+G մագնիսական բշտիկով կոնյուգացված հակա-պիտակավորված հակամարմինով ևս երկու ժամ:Այնուհետև ուլունքները լվացվեցին չորս անգամ 1x RIP բուֆերով և լվացվեցին 1x SDS բուֆերով:Ստացված PACT-ը և PKR-ն հայտնաբերվել են ՀԲ-ի կողմից: